背景巨噬细胞在机体免疫防御中发挥重要的功能,通过分泌趋化因子并刺激黏附分子的产生,可以实现免疫细胞的招募和迁移。另外,巨噬细胞作为机体内广泛存在的专职抗原呈递细胞,通过表达MHC-Ⅱ/肽复合物激活T细胞应答,从而参与特异性免疫反应启动。主要组织相容性复合物Ⅱ（major histocompatibility complex class Ⅱ,MHC-Ⅱ）介导的抗原呈递在移植排斥、肿瘤和自身免疫病中都具有重要作用。肿瘤细胞表面低表达MHC-Ⅱ可以帮助肿瘤细胞逃脱特异性免疫细胞的攻击,自身免疫病中抗原递呈细胞通过表达MHC-Ⅱ分子可以激活大量T细胞,导致适应性免疫应答启动并造成自身免疫损伤。但目前关于巨噬细胞MHC-Ⅱ的表达调控机制仍有待阐明。多发性硬化是一种神经系统炎症性脱髓鞘疾病,致残率高,并且随着经济的发展和老龄化加重,发病率逐年上升,因此也受到越来越多的关注。多发性硬化主要是由MHC-Ⅱ分子过度表达,导致CD4+T细胞异常活化并分泌IFN-γ和IL-17等细胞因子导致疾病损伤,这些细胞因子也可以进一步调控巨噬细胞炎症因子的分泌,使疾病进一步恶化。因此,探索巨噬细胞的抗原呈递功能具有深远的意义。T细胞免疫球蛋白粘蛋白结构域3（T cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3,Tim-3）是继PD-1和CTLA4之后新的明星免疫抑制检查点分子,在T细胞、T调节细胞、DC细胞、B细胞、巨噬细胞和NK细胞表面均能检测到Tim-3表达。Tim-3缺失所诱导的免疫耐受异常与哮喘、过敏和自身免疫病密切相关。而Tim-3过表达则可以抑制T细胞免疫反应导致免疫耗竭,从而诱发慢性病毒感染及肿瘤等。炎症刺激下巨噬细胞表面Tim-3表达下降并导致巨噬细胞向促炎表型极化,分泌IL-1β、TNFα和IL-6等炎性因子直接攻击病原体或诱导细胞表面黏附分子表达促进细胞的迁移能力。Tim-3功能阻断也可通过调节巨噬细胞释放CCL9和CCXL3等趋化因子招募炎性细胞浸润扩大免疫反应。另外巨噬细胞活化也能上调细胞间黏附分子的表达,帮助免疫细胞穿过免疫屏障到达损伤部位发挥作用。以上这些机制不仅介导了细菌和病毒感染的免疫防御过程,在多发性硬化等自身免疫病中同样发挥重要作用,巨噬细胞分泌的表面黏附分子及趋化因子可以招募外周活化的T细胞穿过血脑屏障发挥作用。我们前期的研究表明Tim-3可以通过调控NF-κB,STAT1,Nrf2等信号通路影响巨噬细胞的活化、极化及吞噬等活性,是巨噬细胞稳态调控的关键分子。但对于Tim-3介导的巨噬细胞功能调控在自身免疫病中的机制目前尚不十分清楚。MHC-Ⅱ分子介导的抗原呈递是建立自身抗原免疫耐受的关键,MHC-Ⅱ异常识别、吞噬并呈递自身抗原可导致自身免疫病的发生,比如多发性硬化和类风湿关节炎等。而Tim-3作为重要的免疫抑制检查点是免疫细胞活化的重要开关。Tim-3和MHC-Ⅱ作为两个关键的免疫活性调控分子,但两者之间是否存在内在的联系目前尚不清楚。有意思的是,我们通过GEO数据库的分析发现,Tim-3和MHC-Ⅱ在人外周单核细胞的表达存在负相关关系,那么Tim-3是否可以调节巨噬细胞MHC-Ⅱ的表达?如果是,Tim-3调节MHC-Ⅱ的机制是什么,在多发性硬化中有怎样的意义?因此,我们期望通过探索这些问题来干预MHC-Ⅱ介导的T细胞活化,为与MHC-Ⅱ相关的疾病提供新的预防和治疗思路。目的:1.利用实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimental Autoimmune Encephalomyelitis,EAE）模型探讨Tim-3对巨噬细胞MHC-Ⅱ表达的影响及其在多发性硬化中的意义;2.探讨Tim-3调节巨噬细胞MHC-Ⅱ表达的分子机制及对巨噬细胞抗原吞噬功能的影响;方法与结果:1.EAE模型构建及评价Tim-3信号干预对疾病进展的影响我们首先使用Tim-3-TG,Tim-3-KO,WT小鼠成功构建EAE模型。分别比较Tim-3-KO与WT小鼠,Tim-3-TG与WT小鼠,注射抗Tim-3抗体和对照抗体小鼠的临床评分和体重变化,发现Tim-3敲低或阻断后,小鼠的临床体征更严重,临床评分更高。而Tim-3高表达小鼠的临床症状较WT组小鼠显著减轻,评分也更低。通过组织染色,发现阻断Tim-3可以加重小鼠脊髓的炎症细胞浸润以及神经纤维髓鞘的丢失。说明Tim-3的下调与多发性硬化的疾病进展密切相关。接下来,我们探讨了Tim-3影响多发性硬化的可能机制。2.干预EAE小鼠Tim-3信号可以通过调节巨噬细胞表面MHC-Ⅱ的表达影响CD4+T细胞的活化在GEO数据库发现Tim-3与MHC-Ⅱ的m RNA表达存在负相关关系的基础上,我们利用WT和Tim-3-TG小鼠构建了EAE模型,并检测了EAE小鼠腹腔巨噬细胞MHC-Ⅱ的表达以及脾淋巴细胞活化状态。发现阻断Tim-3功能后,小鼠腹腔巨噬细胞MHC-Ⅱ的基因和蛋白水平均出现明显的上调,脾淋巴细胞中IFN-γ+CD4+T和IL-17+CD4+T细胞明显增多。然而在Tim-3-TG小鼠构建的模型中,腹腔巨噬细胞与WT组比MHC-Ⅱ表达明显降低,且脾淋巴细胞中IFN-γ+CD4+T和IL-17+CD4+T细胞明显减少。接着使用IAb-MOG35-55-Tetramer检测CD4+T细胞表面的特异性TCL功能,结果表明阻断Tim-3导致MHC-Ⅱ/MOG35-55特异性的CD4+T细胞活化增多。由于受到体内实验的限制,我们通过体外共培养腹腔巨噬细胞和脾细胞检测了Tim-3通过调节巨噬细胞MHC-Ⅱ表达对CD4+T的影响,结果表明中和MHC-Ⅱ后,抑制Tim-3功能所导致的IFN-γ+CD4+T和IL-17+CD4+T细胞的分化明显减弱。上述结果说明Tim-3可能通过抑制MHC-Ⅱ表达参与多发性硬化的发生。为了更明确Tim-3对MHC-Ⅱ的调节作用及可能机制,我们通过体外实验对此进行了继续探讨。3.体外实验证明Tim-3抑制巨噬细胞MHC-Ⅱ表达利用RT-PCR和流式以及Western Blot方法检测RAW264.7细胞上Tim-3与MHC-Ⅱ表达关系,结果表明Tim-3抑制MHC-Ⅱ的表达。利用同样的方法检测了Tim-3-KO,Tim-3TG和WT小鼠腹腔巨噬细胞MHC-Ⅱ的表达,以及使用抗Tim-3抗体阻断WT小鼠Tim-3信号后腹腔巨噬细胞MHC-Ⅱ的表达,结果均一致表明Tim-3抑制了MHC-Ⅱ的表达。随后通过梯度转染Tim-3质粒到HEK-293T细胞,发现Tim-3与MHC-Ⅱ的表达呈梯度依赖性。说明Tim-3抑制了巨噬细胞MHC-Ⅱ的表达。4.Tim-3通过抑制CIITA下调MHC-Ⅱ表达为了进一步讨论Tim-3抑制MHC-Ⅱ表达的机制。我们检测了Tim-3对MHC-Ⅱ转录激活因子CIITA的影响。利用RT-PCR和Western Blot方法检测了RAW264.7细胞敲低Tim-3前后CIITA的表达变化,结果表明阻断Tim-3可以上调CIITA的表达。接着,敲低RAW264.7细胞的CIITA,检测Tim-3与CIITA的关系,结果表明敲低CIITA后,Tim-3对MHC-Ⅱ没有显著的调节作用。随后,用CIITA和Tim-3质粒转染HEK-293T细胞并利用Western Blot检测了MHC-Ⅱ的表达,结果同样表明Tim-3通过抑制CIITA下调了MHC-Ⅱ的表达。最后,通过共转Tim-3和CIITA/MHC-Ⅱ荧光报告实验,结果表明Tim-3抑制了CIITA对MHC-Ⅱ的促表达作用。说明Tim-3通过抑制CIITA下调巨噬细胞MHC-Ⅱ的表达。5.Tim-3通过抑制STAT1下调CIITA/MHC-Ⅱ表达文献查阅发现STAT1可以调节CIITA转录,而先前实验室证明Tim-3与STAT1存在相互作用,因此我们检测了Tim-3抑制STAT1后对CIITA/MHC-Ⅱ的表达影响。首先使用STAT1抑制剂阻断RAW264.7细胞的STAT1信号,利用RT-PCR检测了Tim-3与MHC-Ⅱ的关系,结果表明阻断STAT1减弱了Tim-3下调对MHC-Ⅱ的增强作用。接着用STAT1和CIITA转染HEK-293T细胞,利用Western Blot检测了CIITA和MHC-Ⅱ的表达,结果表明STAT1可以促进二者的表达。随后用STAT1和Tim-3转染HEK-293T细胞,利用RT-PCR和Western Blot检测CIITA和MHC-Ⅱ的变化,发现Tim-3阻断了STAT1对CIITA和MHC-Ⅱ的上调作用。说明Tim-3通过抑制STAT1/CIITA下调MHC-Ⅱ的表达。6.Tim-3参与调节巨噬细胞吞噬功能巨噬细胞吞噬抗原是MHC-Ⅱ呈递抗原的重要源头。前期实验室也证明Tim-3能够抑制巨噬细胞吞噬细菌的能力。所以我们考虑Tim-3是否可能通过抑制巨噬细胞的吞噬功能影响MHC-Ⅱ对抗原的呈递作用。因此我们初步探讨了Tim-3调节巨噬细胞吞噬功能的可能机制。结果发现Tim-3可以通过抑制Nrf2-COX-2信号通路影响巨噬细胞的吞噬功能,从而干预巨噬细胞的抗原呈递作用并影响自身免疫稳态。结论1.阻断Tim-3功能通过上调巨噬细胞MHC-Ⅱ表达增强了CD4+T活化并加重了EAE进展2.Tim-3通过STAT1/CIITA信号通路抑制了巨噬细胞中MHC-Ⅱ的表达,并通过COX-2抑制了巨噬细胞对抗原的吞噬。