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研究背景肺纤维化在早期肺泡炎和后期的纤维化过程中有复杂的细胞及细胞因子网络参与。肺成纤维细胞是肺纤维化形成中起重要作用的间质细胞,细胞外基质(ECM)的主要来源,肺成纤维细胞的增殖分化、ECM的沉积和各种炎性细胞的聚积与分化是肺纤维化发生和发展的核心环节。相关的细胞因子及激酶大多由肺实质细胞或浸润的炎性细胞释放,可刺激成纤维细胞增殖,使胶原等细胞外基质合成增加,降解减少,导致肺泡壁和间质发生纤维化。近年来众多研究表明,局部组织肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)广泛地存在于各组织器官之中,对组织器官纤维化的形成具有促进作用。其中ACE-AngⅡ-AT-1R轴是RAAS致纤维化的重要因素。其效应分子血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是重要的致炎因子,可促进细胞增殖和细胞外基质(ECM)的合成。研究发现MAPK、RhoA-Rock、Smad、NF-κB等信号通路与炎症和组织纤维化密切相关,它们可被各种致炎因子激活,负责调控与炎症和纤维化有关的基因如TGF-β1、Ⅰ型胶原、CTGF、ICAM-1的转录及表达,参与肺成纤维细胞的激活、转化和ECM的合成,对肺纤维化的发生和发展具有重要作用。ACE2-Ang(1-7)-Mas受体轴是新发现的RAAS成分,对ACE-AngⅡ-AT-1R轴有负调控作用,对肺、心、肾的损伤具有保护作用。Ang(1-7)的重要作用是抑制AngⅡ诱导的炎症损伤和细胞增殖。ACE2-Ang(1-7)-Mas受体轴对于ACE-AngⅡ-AT-1R轴的抑制作用表明,ACE2-Ang(1-7)-Mas受体轴可能是器官纤维化的治疗新靶点。然而目前有关ACE2-Ang(1-7)-Mas受体轴对肺纤维化的影响机制不甚明确,鲜见相关研究报道。本研究为了深入探讨AngⅡ诱导肺纤维化的形成机制以及ACE2-Ang(1-7)-Mas受体轴对肺纤维化的影响,试图从分子和细胞水平分析AngⅡ和Ang(1-7)对肺成纤维细胞中MAPK、RhoA-Rock、Smad、NF-κB信号通路的影响,为肺纤维化的治疗提供新的靶点及依据。方法在第一部分中本研究培养人胚肺成纤维细胞(HFL-1)细胞株,分别予AngⅡ0.1μM和Ang(1-7)0.1μM刺激20min,提取总蛋白,western blot方法检测P-ERK1/2、P-P38、P-JNK、ERK1/2、P38、JNK(MAPK通路)、RhoA(RhoA-Rock通路)、Smad3、p-Smad3、Smad4(Smad通路)蛋白表达、免疫荧光方法检测p-Smad3核转位;刺激60min,提取浆蛋白检测IκBα、p-IκKα/β(NF-κB通路)蛋白表达、免疫荧光检查NF-κB核转位、EMSA方法检测NF-κB DNA结合活性;刺激24h,提取蛋白检测CTGF表达、提取RNA检测TGF-β1、α1-Ⅰ型胶原、CTGF、ICAM-1基因表达。AT-1R拮抗剂Irbesartan、P38抑制剂SB203580、ERK抑制剂PD98059、ROCK抑制剂Y27632预处理1小时后再予AngⅡ刺激检测上述指标变化。将Ang(1-7)和AngⅡ同时刺激细胞,观察上述指标,以及Mas受体拮抗剂A779预处理后再予Ang(1-7)和AngⅡ同时刺激,观测上述指标。第二部分构建lenti-ACE2慢病毒载体,感染HFL-1,观察ACE2过度表达的情况下,下游因子TGF-β1、CTGF、α1-Ⅰ型胶原、ICAM-1基因表达及CTGF蛋白表达情况。结果一、血管紧张素Ⅱ和血管紧张素1-7对人胚肺成纤维细胞(HFL-1)纤维化相关信号通路调控机制的体外研究。1.AngⅡ和Ang(1-7)对HFL-1中MAPK通路的影响。AngⅡ可诱导ERK1/2、P38、JNK的磷酸化,Irbesartan、Ang(1-7)对其有抑制作用,Mas受体阻断剂A779可阻断后者的抑制作用。Ang(1-7)可诱导ERK1/2的磷酸化:抑制P38的磷酸化,对JNK磷酸化没有影响。2.AngⅡ和Ang(1-7)对HFL-1中RhoA-Rock通路的影响。AngⅡ对HFL-1细胞RhoA表达有显著诱导作用,该作用可分别被Irbesartan、SB203580和PD98059抑制;Ang(1-7)对RhoA有诱导作用,并可抑制AngⅡ对RhoA的诱导,该作用可被A779阻断而使RhoA表达增强。3.AngⅡ和Ang(1-7)对HFL-1中Smad通路的影响。AngⅡ干预20min后p-Smad3的表达由胞浆向细胞核转位,同时pSmad3、Smad4明显增高。Irbesartan可抑制pSmad3、Smad4表达和p-Smad3的核转位,SB203580可抑制AngⅡ诱导pSmad3、Smad4表达,PD98059可抑制AngⅡ诱导的pSmad3表达。Ang(1-7)可抑制AngⅡ诱导的p-Smad3的表达,A779无法阻断。Ang(1-7)也可诱导pSmad3表达和p-Smad3的核转位。4.AngⅡ和Ang(1-7)对HFL-1中NF-κ3通路的影响。AngⅡ可诱导p-IκKα/β升高、胞浆内IκBα蛋白质水平降低,NF-κB的DNA结合活性增强,NF-κB核转位,并可被Irbesartan、PD98059抑制,不能被SB203580抑制。Ang(1-7)可拮抗AngⅡ诱导的p-IκKα/β水平升高、胞浆内IκBα水平减低以及增强的DNA结合活性,A779又能阻断Ang(1-7)对AngⅡ的抑制作用。Ang(1-7)单独作用可诱导胞浆内IκBα减低,NF-κB的DNA结合活性增强,NF-κB核转位,但相应的p-IκKα/β并没有显著升高。AngⅡ干预48小时后,NF-κB调控的下游因子ICAM-1 mRNA表达增强,该作用可分别被Irbesartan、SB203580、PD98059、NAC抑制:Ang(1-7)能拮抗AngⅡ的诱导作用,且可被A779阻断;Ang(1-7)单独作用能诱导ICAM-1增加。5.AngⅡ和Ang(1-7)对TGF-β1的影响。AngⅡ干预24小时后,HFL-1细胞TGF-β1mRNA表达增强,且该作用可被Irbesartan、SB203580、Y27632、Ang(1-7)抑制。A779能阻断后者对于AngⅡ的抑制作用。Ang(1-7)单独干预HFL-124小时后,HFL-1细胞TGF-β1mRNA无明显增加。6.AngⅡ和Ang(1-7)对CTGF的影响。AngⅡ对HFL-1细胞CTGF蛋白表达有显著诱导作用;Irbesartan、SB203580、PD98059、Y27632均可抑制AngⅡ诱导的CTGF的表达。Ang(1-7)诱导CTGF合成,抑制AngⅡ诱导的CTGF表达,该作用可被A779阻断而使CTGF表达增强。7.AngⅡ和Ang(1-7)对α1-Collagen的影响。AngⅡ干预24、48小时后,HFL-1细胞α1-Collagen mRNA表达增强,该作用可分别被Irbesartan、SB203580、PD98059抑制,不能被Y27632抑制。Ang(1-7)能拮抗AngⅡ的诱导作用。Ang(1-7)单独作用不能诱导α1-Collagen mRNA增加。二、lenti-ACE2慢病毒对AngⅡ诱导纤维化相关因子的影响1.构建lenti-ACE2慢病毒载体并成功转染人胚肺成纤维细胞,倒置荧光显微镜显示病毒转染后细胞内有明显GFP荧光,而未转染组未见明显荧光。经western blot证实lenti-ACE2慢病毒转染组ACE2表达升高,2.lenti-ACE2慢病毒转染对HFL-1 TGF-β1 mRNA的影响。lenti-ACE2慢病毒和空载体转染后TGF-β1 mRNA的表达较对照组没有变化。AngⅡ分别刺激未转染病毒和转染了lenti-ACE2慢病毒的HFL-1后,前者TGF-β1 mRNA明显升高,后者较前者明显降低,A779预处理后,AngⅡ可刺激lenti-ACE2转染组TGF-β1 mRNA表达增强。3.lenti-ACE2慢病毒转染对HFL-1α1-Collagen mRNA的影响。病毒转染后HFL-1细胞α1-Collagen mRNA表达升高;AngⅡ刺激转染了lenti-ACE2的HFL-1后α1-Collagen mRNA表达降低,A779预处理1小时,再予以AngⅡ刺激α1-Collagen mRNA表达升高。4.lenti-ACE2慢病毒转染对HFL-1 CTGF的影响。检测CTGF蛋白水平发现病毒空载体感染细胞96小时后CTGF蛋白水平较对照组明显升高,lenti-ACE2感染细胞后CTGF表达较空载体降低。5.lenti-ACE2慢病毒转染对HFL-1 ICAM-1 mRNA的影响。检测ICAM-1mRNA水平发现病毒空载体感染细胞96小时后ICAM-1 mRNA水平较对照组明显升高,lenti-ACE2感染细胞后ICAM-1 mRNA较空载体组降低。结论通过以上研究可以得出以下结论:1.AngⅡ可以经过AT1受体诱导HFL-1表达纤维化相关细胞因子TGF-β1、CTGF、ICAM-1,并促进α1-Ⅰ型胶原合成。在此过程中MAPK、RhoA-Rock、Smad、NF-κB信号通路分别参与作用。其中TGF-β1的表达通过P38MAPK/RhoA-Rock通路诱导;CTGF表达通过P38 MAPK/RhoA-Rock、ERKMAPK/RhoA-Rock通路诱导;α1-Ⅰ型胶原通过P38 MAPK、ERK MAPK通路诱导;ICAM-1通过ERK MAPK/NF-κB、P38 MAPK通路诱导。2.AngⅡ激活的信号通路之间存在相互作用。其中MAPK中的P38参与调控RhoA-Rock、Smad信号通路的激活,P38特异的抑制剂SB203580可以抑制上述通路的激活。ERK参与调控RhoA-Rock、Smad、NF-κB信号通路的激活,ERK1/2特异的抑制剂PD98059可以抑制上述通路的活化。3.Ang(1-7)具有双重作用,可以分别激活ERK MAPK、RhoA-Rock、Smad、NF-κB通路,同时通过Mas受体抑制AngⅡ激活MAPK、RhoA-Rock、NF-κB通路,通过非Mas受体拮抗AngⅡ诱导的Smad通路激活,从而发挥对AngⅡ的拮抗作用。4.Ang(1-7)的双重作用还表现在它可以诱导CTGF、ICAM-1表达,又可以通过Mas受体抑制AngⅡ诱导TGF-β1、CTGF、ICAM-1的表达,Ang(1-7)抑制AngⅡ诱导α1-Collagen合成,但可能不通过Mas受体。5.lenti-ACE2慢病毒可以保护人胚肺成纤维细胞,一方面通过降低慢病毒空载体诱导的CTGF、Ⅰ型胶原、ICAM-1 mRNA表达,另一方面抑制AngⅡ诱导的TGF-β1、Ⅰ型胶原表达升高,Mas受体拮抗剂A779可以阻断这一作用,提示ACE2裂解AngⅡ产生Ang(1-7),通过Mas受体发挥对AngⅡ拮抗作用。小结本实验系统阐明AngⅡ对肺成纤维细胞纤维化相关信号通路及下游因子的调控机制,发现Ang(1-7)具有双重作用;阐明ACE2-Ang(1-7)-mas受体轴对AngⅡ诱导的上述信号通路的抑制作用,为肺纤维化防治提供新的靶点及试验依据。