研究背景及研究目的:　　免疫是指机体免疫系统识别自身与异己物质,并通过免疫应答排除抗原性异物,以维持机体生理平衡的功能。而淋巴细胞则是免疫系统的重要组成部分,他可以通过直接或间接的方式来参与肿瘤的发生和发展,包括分泌细胞因子来改变机体的免疫状态和肿瘤微环境、直接浸润到肿瘤组织中促进或抑制肿瘤细胞的生长等。众所周知,浸润到肿瘤微环境的免疫细胞包括先天性和适应性免疫应答细胞,如树突细胞,B淋巴细胞和包括CD4+T和CD8+T细胞亚群的T淋巴细胞[1]。Galon J et al.等研究表明表明,肿瘤组织中CD3+T细胞的密度是唯一的与病人的总生存相关联的指标[2]。然而, CD3+T细胞包括CD4+T细胞亚群和CD8+T细胞亚群,到底是哪个细胞亚群在这其中起主要作用还不是很清楚。除了对T细胞的探讨,Julie S et a等研究表明,在高分化卵巢癌中,肿瘤浸润性CD20+B细胞(CD20+TIL)与患者的生存期有着紧密的联系[3],在其他肿瘤中也如此,如乳腺癌[4]和宫颈鳞状细胞癌[5]。然而,CD20+TIL在结直肠癌中的作用尚不清楚[6]。所以在本研究中,我们通过免疫组化检测结直肠癌组织芯片中CD4+,CD8+和CD20+ TIL在其瘤组织和癌旁组织中的浸润情况,然后分析这些淋巴细胞亚群的结直肠癌患者中潜在的临床意义。　　研究方法:　　1、制作结直肠癌组织芯片。　　2、免疫组化检测组织芯片中CD4+,CD8+和CD20+TIL在其瘤组织和癌旁组织中的浸润情况。　　3、分析CD4+,CD8+和CD20+TIL与结肠癌临床病理特征的关系。　　结果:　　1、从免疫组化可以看出,无论是在肿瘤组织还是在癌旁组织,CD4+,CD8+和CD20+TIL的浸润都可以很明显的分为高浸润组和低浸润组。但是,相对于T细胞亚群来说, CD20+B细胞浸润的数量很少,特别是在肿瘤组织中。　　2、统计分析表明,肿瘤组织中,浸润淋巴细胞亚群的量与患者的年龄、瘤大小、N分类和肿瘤分期之间没有任何关系。然而在肿瘤组织中, T1和T2期的患者比T3和T4期的患者有更高密度的CD20+B细胞的浸润。此外,在癌旁组织中,M0期的患者比M1期的患者有更高密度的CD8+T细胞的浸润。　　结论:　　本研究发现肿瘤组织中浸润的CD8+ T细胞和B细胞与结直肠癌的分期有一定的相关性。然而,考虑到CD4+T细胞的高异质性,所以有必要进一步研究浸润性CD4+T细胞亚群的作用。此外,研究CD20+肿瘤浸润淋巴细胞潜在的抗肿瘤机制有着重要的临床意义。此研究将对结直肠癌病人制定更有效的免疫疗法有很大的提示意义。　　研究背景及研究目的:　　我们的研究发现,肿瘤组织中浸润的CD20+ B和CD8+ T细胞与肿瘤病人的病理参数有着一定的关系[1]。然而,众所周知,参与抗肿瘤的T细胞主要是CD8+T淋巴细胞,而一系列的研究证明,初始CD8+T淋巴细胞在接受抗原刺激后会首先生成特异性的效应CD8+T淋巴细胞发挥其功能,而后这形成的90％-95%的特异性效应CD8+T淋巴细胞在抗原清除后都死亡[2],几周之内,少量生存的特异性CD8+T淋巴细胞会进一步分化成高表达CD62L和CCR7的记忆细胞[3]。当这群记忆细胞再次遭受相同抗原刺激时,会表现为特异性的克隆增殖能力及强有力的清除抗原的能力[4]。也有研究表明,在抗原刺激后生成的特异性效应细胞中有前体记忆CD8+T细胞的存在,只是不表现为记忆细胞的功能。在抗原清除几周之后,这群抗原特异性的前体记忆CD8+T细胞的基因表达谱发生改变,获得了记忆细胞的功能,即包括再次遭受抗原刺激时表现出的快速的增值能力、细胞杀伤能力及高分泌细胞因子的能力,同时这群抗原特异性的前体记忆CD8+T细胞的表面分子CCR7和CD62L的表达升高且细胞的生存能力都明显增强[5]。这表明前体记忆CD8+T细胞是存在于早期免疫反应中,只是在抗原清除后的几周之内才会形成有保护作用的记忆细胞,并且这些记忆细胞高表达细胞表面分子 CCR7和CD62L[1]。　　CCR7和CD62L是淋巴细胞归巢到脾脏、淋巴结等次级淋巴器官的重要分子[2]。在早期的研究发现,通过不同的归巢分子,特别是CCR7和CD62L,可以区分至少两种记忆CD8+T细胞亚群[3],但是这些记忆细胞的形成机制还不是很清楚,在决定哪些细胞变为记忆细胞而哪些细胞趋于死亡的这个过程还有待阐明,推测其最大的阻碍可能是缺少特异性的标志来区分生存细胞和死亡细胞的发展过程[4]。记忆细胞是高表达IL-7受体α链(CD127)的,越来越多的学者研究发现,无论是在动物模型中还是在病人体内[5],CD127的表达对 CD8+T细胞的记忆性的形成和成熟有着至关重要的作用[6]。已有研究表明,在效应 CD8+T细胞反应的高峰时期,有一小部分效应 CD8+T细胞高表达细胞表面分子CD127(IL-7Rα),且CD127的表达率与生成的记忆细胞的量成明显正相关。因此推测, CD127hiT细胞是前体记忆 T细胞[7]。并且将 CD127hi和CD127lo的T细胞对小鼠进行ACT治疗发现,CD127hiT细胞有更强的保护机体的能力和成为长效记忆细胞T细胞的能力[8]。众多研究表明,IL-7信号是记忆T细胞所必须的,这表明CD127的表达并不只是与记忆细胞的数量有关,他还是记忆细胞的功能的形成所必须[9]。因此我们猜想,是否存在高表达CD127的同时也高表达CCR7或CD62L的一群CD8+T细胞,如果存在,这群细胞将有什么样的功能,本文将以黑色素瘤小鼠为模型,就此问题进行探讨。　　研究方法:　　1、制备黑色素瘤小鼠模型,流式细胞仪检测黑色素瘤小鼠和正常小鼠的血液、脾脏和骨髓中表达CD8、CD62L、CCR7和CD127的各细胞亚群的比例,找出目的细胞亚群,即CD8+CD62L+CD127+T细胞亚群。　　2、免疫组化(IHC)、免疫荧光(IF)及磁珠分选和流式细胞术检测黑色素瘤组织中目的细胞群的浸润情况。　　3、流式细胞仪分选目的细胞群,用MTT法检测目的细胞群的增值情况、流式细胞术检测目的细胞群的凋亡情况及Q-PCR和ELISA检测细胞因子IFN-γ的分泌。　　4、将分选的目的细胞群用CFSE标记后,回输入黑色素瘤小鼠体内,检测其目的细胞群在体内的分布情况。　　5、观察分选出的目的细胞群在体内的抗肿瘤效果。　　实验结果:　　1、从黑色素瘤小鼠和正常小鼠的血液、脾脏和骨髓中分离出淋巴细胞,经流式检测显示,与正常小鼠的脾脏淋巴细胞相比,黑色素瘤荷瘤小鼠的脾脏淋巴细胞中CD8+CCR7+T细胞、CD8+CD62L+T细胞、CD8+CD127+T细胞、CD8+CD62L+CD127+T细胞、CD8+CD62L+CC7+T细胞、CD8+CCR7+CD127+T细胞和 CD8+CCR7+CD62L+CD127+T细胞的比例都发生了不同程度的改变。经统计结果分析发现,在这些CD8+T细胞亚群中,黑色素瘤荷瘤小鼠脾脏中的CD8+CD127+T细胞、CD8+CD62L+T细胞和CD8+CD62L+CD127+T细胞的频率显著高于正常对照小鼠(P<0.05),但外周血和骨髓中的所有这些细胞的频率在黑色素瘤荷瘤小鼠与正常小鼠之间没有显著性差异。因很少有学者对CD8+CD62L+CD127+T细胞进行研究,所以本研究以此细胞群作为目的细胞群进行研究。　　2、从组织化学(IHC)的结果可以得出,在黑色素瘤组织中,有明显的 CD8+TIL的浸润,且在癌旁成簇状分布,在肿瘤组织中成散在分布。同时,肿瘤组织的管腔中也有 CD8+TIL的浸润。免疫荧光双染可以观察到,肿瘤组织中有散在的CD8+CD127+TIL的分布。经磁珠分选 CD8+TIL后用流式细胞术检测肿瘤浸润淋巴细胞亚群,发现肿瘤组织中有 CD8+CD62L+CD127+TIL细胞的存在,且比例占9%-10%左右。　　3、MTT检测显示,将CD8+CD62L+CD127+T细胞与CD8+CD62L+CD127-T细胞和CD8+T细胞相比,CD8+CD62L+CD127+T细胞的增值能力明显增强,差异具有统计学意义(P<0.05)。而流式细胞术检测显示,CD8+CD62L+CD127+T细胞的凋亡能力比CD8+CD62L+CD127-T细胞、CD8+T细胞的凋亡能力要弱,差异具有统计学意义(P<0.05)。用 Q-PCR检测 IFN-γ的 mRNA发现,与 CD8+T细胞相比, CD8+CD62L+CD127+T细胞内 IFN-γ的 mRNA水平是显著下降的(P<0.01),同时将CD8+CD62L+CD127-T细胞内IFN-γ的mRNA水平与CD8+ T细胞内IFN-γ的mRNA的水平进行比较,CD8+CD62L+CD127-T细胞内IFN-γ的mRNA水平也是显著降低的(P<0.05)。Elisa检测其蛋白分泌情况,结果与mRNA的检测结果是一致的。　　4、将CD8+CD62L+CD127+T细胞群用CFSE标记后回输入黑色素瘤小鼠体内后发现,回输的细胞大多聚集在脾脏和淋巴结中,肿瘤组织中也有散在分布的回输淋巴细胞的存在,而肝脏、肾脏则几乎没有观察到回输细胞的分布。　　5、将分选出的CD8+CD62L+CD127+T细胞和CD8+T细胞在体外刺激培养后回输入黑色素瘤小鼠体内,发现 CD8+CD62L+CD127+T细胞的抑制肿瘤生长的能力比CD8+T细胞的抑制肿瘤生长的能力强。　　结论:　　1、黑色素瘤荷瘤小鼠脾脏中CD8+CD127+、CD8+CD62L+和CD8+CD62L+CD127+T细胞亚群的频率显著高于正常对照小鼠。提示这三个细胞亚群有可能参与了小鼠黑色素瘤的发生与发展。　　2、黑色素瘤组织中能检测到 CD8+T淋巴细胞的浸润,且 CD8+CD62L+CD127+T细胞亚群的比例可达到9%-10%左右,提示这增高的细胞亚群有可能直接参与了黑色素瘤的发生和发展。　　3、与CD8+CD62L+CD127-T细胞和CD8+T细胞相比,CD8+CD62L+CD127+T细胞的增值能力增强,但凋亡能力减弱,这可能是脾脏中CD8+CD62L+CD127+T细胞亚群比例升高的直接原因;与此同时,CD8+CD62L+CD127+T细胞分泌 IFN-γ的能力是降低的,这与记忆细胞有着相似的特性。　　4、将CD8+CD62L+CD127+T细胞回输入黑色素瘤小鼠体内,可以发现这群细胞可以归巢到脾脏、淋巴结等二级淋巴器官和肿瘤组织中,以此推测,用 CD8+CD62L+CD127+T细胞去过继细胞治疗黑色素瘤可能会取得良好的效果。　　5、体内抗肿瘤能力的研究发现,CD8+CD62L+CD127+T细胞的抑制肿瘤生长的能力明显比CD8+T细胞的抑制肿瘤生长的能力强,这会对以后的肿瘤病人施行个体化免疫治疗有很好的提示作用。