众所周知,癌症已经成为威胁人类健康的最大杀手之一,而癌症的免疫治疗由于其高效、有记忆性和普遍性的特征而越来越被人们所关注。过去的几十年来,化学疗法、放射疗法和手术疗法都取得了很大的进展,但大多数癌症仍然难以治愈。相对于传统的化疗和放疗,免疫治疗引起更少甚至不引起副反应。未来,肿瘤的免疫疗法将与化疗、放疗、手术一起,成为肿瘤治疗最主要的方法之一。肿瘤相关糖抗原(tumor-associated carbohydrate antigens,TACAs)是一类肿瘤细胞表面特异性表达的分子标志物,他们与肿瘤细胞的转移和侵袭都有不同程度的联系。唾液酸化Lewisx(sialyl Lewisx,sLex)是表达在胚胎组织及肿瘤细胞表面糖脂及糖蛋白上的含有寡聚糖的一组糖抗原。研究表明,sLex作为粘附分子E-选择素(E-selectin)的配基,在一些恶性上皮性肿瘤浸润、转移过程中发挥重要作用。在结肠癌细胞中,sLex与C型凝集素有高亲和力,富含sLex抗原的肿瘤细胞可以借助E-selectin实现其与血管的粘附,从而促使癌细胞从原发肿瘤部位脱落,参与结肠癌细胞穿出血管进入正常组织形成转移灶的过程。TACAs为肿瘤疫苗的设计和研发提供了合适的靶标,但是由于TACAs是非T细胞依赖抗原,导致它并不能引起有效的免疫反应,且容易引起免疫耐受。为了解决这个问题,常常用连接蛋白载体的方法使糖抗原由非T细胞依赖抗原转化为T细胞依赖抗原,提升其免疫原性。CRM197蛋白是一种白喉毒素突变体,它的第52位氨基酸残基由甘氨酸突变为谷氨酸,使它失去了毒性,却保留了与白喉毒素相同的免疫原性和炎症性,使它具有良好的免疫原型和安全性。因此,CRMW被广泛使用为糖疫苗的蛋白载体。本课题用基因工程技术在大肠杆菌中对CRM197蛋白进行了表达,将重组的CRM197作为蛋白载体,sLex作为糖抗原,合成了 CRM197-sLex结合物疫苗,并对其进行了免疫学研究。主要研究内容与结果如下。1 CRMW蛋白的表达和纯化用基因工程的方法将pET22b-crm197质粒转入大肠杆菌BL21中,目的蛋白CRM197以包涵体的形式表达。通过对包涵体的洗涤、变性和稀释复性,最终得到可溶、稳定、高纯度、高收率的CRM197目的蛋白。在1 inmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、37℃诱导表达的条件下,每1 L菌液可以获得纯化的 CRM197 55 mg。2糖蛋白结合物疫苗的合成及其合成效率测定用“点击化学”的方法将sLex糖链与人血清白蛋白(HSA)和CRM197蛋白进行偶联,使用的连接臂为方酸二乙酯。得到的糖结合物疫苗用MALDI-TOF-MASS进行分析。经计算,平均一分子HSA大约可连接sLex四糖分子11.8个,其载糖率约为13.1%;平均一分子CRM197大约可连接sLex四糖分子13.3个,其载糖率约为16.0%。3糖蛋白结合物疫苗的免疫学评价用合成的CRM197-sLex结合物疫苗对C57小鼠进行免疫并取得抗血清,抗血清用ELISA的方法进行抗体滴度、抗体分型的分析。抗体滴度分析中,CRM197-sLex结合物免疫的抗血清可以产生较高的抗体滴度(1:24300);抗体分型分析中发现,CRM197-sLex结合物免疫产生的抗血清中抗体类型主要为IgG,尤其是IgG2c和IgG2b。最后,用CCK-8法测定抗原抗体复合物介导的补体依赖的细胞毒作用(CDC)。CRM197-sLex结合物免疫产生的抗血清在补体存在的情况下,可以对人肺癌A549细胞产生较强的杀伤作用,补体存在下细胞与抗血清共孵育存活率仅为1 2.80%,灭活补体的对照组存活率为97.88%,仅与补体孵育的细胞存活率为74.23%。结论和意义本研究成功合成了 CRM197-sLex结合物疫苗,并对其进行了免疫学评价。该结合物疫苗显示出了较好的免疫原性,可以刺激C57小鼠产生较高的抗体滴度,并且该抗体在补体存在的情况下可以杀伤表达该抗原的肿瘤细胞。本研究为基于sLex的糖疫苗的设计和研究提供了基础,也为肿瘤免疫治疗在治疗肿瘤中的作用和意义提供了理论依据。