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目的在已有对通窍活血汤相关研究的基础上,对该方组成药材之一的大葱的不同提取工艺制备得到的提取物,进行神经保护作用的药效学研究筛选,确定其最佳提取工艺,分析其进入脑缺血大鼠脑脊液中的药物成分,并开展其含药脑脊液对谷氨酸损伤的PC12细胞的保护作用的研究。方法1.葱提取方法的筛选:提取方法有超临界流体萃取、水蒸气蒸馏法、石油醚浸提、80%乙醇提取、50%乙醇提取和水煮法。将不同方法的葱提取物给予谷氨酸损伤的PC12细胞,通过MTT法分析细胞活力,筛选出最佳提取工艺。2.利用线栓法阻塞大鼠大脑中动脉,制备脑缺血大鼠模型,并对模型进行评价。3.用已优化的葱提取方法,制备葱提取物,分别给予假手术组及脑缺血模型组大鼠,对照组假手术组及脑缺血模型组大鼠灌胃蒸馏水,采集并制备含药及空白脑脊液样品。4.采用GC-MS等方法分析进入脑脊液中葱的成分。5.葱含药脑脊液对谷氨酸损伤的PC12细胞的保护作用研究:采用倒置显微镜观察各组细胞形态学变化,MTT法检测细胞活力、LDH法检测细胞膜的通透性。采用流式细胞仪检测对谷氨酸诱导的PC12细胞凋亡的影响。6.采用western-blotting法检测Bcl-2,Bax,caspase-3和caspase-9的表达,分析细胞凋亡机制。结果1.葱提取方法的筛选结果显示,葱的50%及80%的乙醇提取物的8个不同剂量对谷氨酸损伤的PC12细胞均有保护作用。考虑到50%更加环保和经济,最终采用50%乙醇对葱进行提取。2.葱提取物灌胃给予大鼠后脑脊液成分的GC-MS分析采用GC-MS方法对各组脑脊液样品以及葱50%乙醇提取的提取物进行对比分析,结果显示,能够进入脑缺血模型组大鼠脑脊液的葱的成分为十六烷酸甲酯,环戊烷十一烷酸甲酯,5,8-二甲基十二烷。其中假手术组脑脊液也检测到5,8-二甲基十二烷。3.葱的提取物灌胃给与大鼠后脑脊液对谷氨酸损伤的PC12细胞的保护研究(1)MTT法结果显示,用浓度为25 mmol/L的谷氨酸损伤PC12细胞24 h后,细胞生长抑制率为50%,与模型组相比,15%假手术组大鼠含药脑脊液和脑缺血组大鼠含药脑脊液对谷氨酸损伤的PC12细胞有一定的保护作用。(2)LDH结果显示,与模型组相比15%假手术组大鼠含药脑脊液和脑缺血组大鼠含药脑脊液对谷氨酸损伤的PC12细胞乳酸脱氢酶的泄漏有一定的抑制作用。(3)Annexin V/PI-FITC的检测结果显示,与模型组相比15%假手术组大鼠含药脑脊液和脑缺血组大鼠含药脑脊液均可显著减少谷氨酸损伤的PC12细胞的细胞凋亡率。(4)Western-Blotting蛋白表达结果显示,与模型组相比15%假手术组大鼠含药脑脊液和脑缺血组大鼠含药脑脊液均可显著下调Bax、caspase-3和caspase-9蛋白的表达,显著上调了Bcl-2的表达,且Bcl-2/Bax的比值增加。结论实验结果表明葱有效成分的最佳提取方法为50%乙醇提取,分析结果显示能够进入脑缺血模型组大鼠脑脊液的葱的成分为十六烷酸甲酯,环戊烷十一烷酸甲酯,5,8-二甲基十二烷。其中假手术组及脑缺血组脑脊液均含有的成分为5,8-二甲基十二烷,这几种成分能够透过血脑屏障进入脑脊液,此成分的神经保护作用的药效学有待进一步开展。葱含药脑脊液抗凋亡的主要作用机制为降低caspase-3和caspase-9蛋白的表达,降低Bax表达,增加Bcl-2的表达,从而减少PC12细胞的凋亡。