背景：现代毛发修复外科技术,虽然其疗效肯定、持久,得到广大秃发患者的认可,但实践证明无论是哪一种修复技术的采用,都是以患者自体拥有充足的供区毛发为前提。对于秃区面积过大,甚至毛发完全缺失的患者,这些修复技术常无法开展。即便开展,也由于供区不足、移植成活率不稳定等因素,手术后的毛发密度也无法达到满意效果。况且任何外科手术都不会产生新的头发,不会增加头发的数量。许多秃发患者头发的丢失是进行性的,毛发修复也不能逆转或使其停止,也无法预测其发展情况。所以,供区毛发资源明显不足,成为现今毛发修复外科较难解决的问题。毛发发生过程是胚胎上皮细胞和间充质细胞相互作用所致。在毛发发育早期,间充质细胞聚集于上皮细胞下,随后形成真皮聚集物,最后形成真皮乳头并促使毛囊发育成熟。在此基础上发展出的毛囊细胞移植技术(follicular cell implantation、FCI),是将具有毛囊诱导能力的细胞,如成体真皮乳头细胞(dermal papilla cells、DPCs)、真皮鞘细胞、胚胎或新生真皮细胞等目标细胞,进行培养扩增,而后将其植入秃发区,重新模拟毛囊发育过程,并最终诱导出许多新生毛囊来。许多研究者发现从成年生长期毛囊分离出的真皮乳头放于表皮附近可诱导形成新的毛囊。另有学者从新生鼠皮肤分离真皮细胞注射至成年裸鼠躯干皮下,8-12天可形成新的毛囊,并具有毛发周期性。这些实验都为FCI技术提供了实验基础。而目前该技术主要障碍在于,毛囊细胞诱导能力流失之前仅能做到几次倍增。如不能获得大量细胞的同时保持诱导能力,细胞移植方法就无法在同毛发移植手术的比较中取得优势。具有毛囊诱导功能的永生化细胞株构建为FCI技术突破技术瓶颈提供了一个新的方向。目前研究证实细胞衰老与细胞内染色体端粒程序性缩短有关。当端粒缩短至一定限制长度时,细胞脱离细胞周期而停止生长。端粒酶是一种逆转录酶,由RNA及相关蛋白组成,它以自身RNA为模板逆转录合成端粒重复序列以维持端粒长度。端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)是端粒酶的催化亚单位,它的表达与端粒酶活性有强烈的相关性,是端粒酶激活的决定因素。将TERT基因导入后,细胞可以稳定表达端粒酶,并在一个相当长时间的保持染色体组正常同时以正常方式持续生长。如果能建立成熟的永生化毛囊细胞株技术,也可为获得大量稳定的具有诱导能力的种子细胞提供一个新的方法。在本实验中我们构建逆转录病毒载体pLEGFP-N1-TERT,尝试将TERT基因导入新生鼠真皮细胞来保持细胞毛囊诱导能力,延长细胞的寿命,为毛囊细胞移植提供良好的种子细胞来源。同时将获得的TERT高表达的新生鼠真皮细胞,培养后植入裸鼠皮下,初步探讨FCI。目的：1.建立新生C57小鼠真皮细胞分离、培养、鉴定方法1.1建立获得含毛囊诱导能力的C57小鼠真皮细胞方法,提供种子细胞的真皮成分；1.2培养真皮细胞,观察细胞形态及生长周期；1.3确认真皮细胞表达的代表毛囊诱导能力的各项指标。2.建立永生化真皮细胞的方法2.1确定TERT引物设计,合成,构建载体方法；2.2病毒包装,细胞转染,稳定细胞株的筛选；2.3获得稳定细胞株培养观察,检测毛囊诱导能力。3.建立细胞移植动物体内诱导毛囊模型3.1确认细胞移植方法；3.2细胞示踪,确认移植细胞参与形成的毛囊成分。方法：1.基因选取及引物序列设计：根据pLEGFP-N1表达载体图谱,从NCBI选定TERT基因序列(NM：009354)进行分析,设计如下引物：TERT-F:5’CCCAAGCTTATGACCCGCGCTCCTCGTTG3’; TERT-R:5’ACGCGTCGACCGGTCCAAAATGGTCTGAAAGTCTGT3’。2.载体构建及检测：从新鲜小鼠肝脏组织提取RNA,反转录为CDNA后行PCR扩增。反应结束后,反应液进行琼脂糖凝胶电泳检测反应产物。采用DNA回收试剂盒从PCR产物中回收约3369bp目的片段。把TERT胶回收产物和pLEGFP-N1载体分别用HindⅢ和Sal I进行酶切后,用T4DNA连接酶进行连接,转化大肠杆菌,经过菌落PCR,酶切鉴定后送去英骏公司测序。挑取菌落PCR鉴定出来的单克隆进行培养,用普通质粒提取试剂盒提取质粒,用BamHI进行单酶切鉴定。3.质粒小提：采用碱裂解大肠杆菌,再通过离心吸附柱在高盐状态下特异地结合溶液中的DNA。离心吸附柱使用硅基质材料,高效、专一吸附DNA。同时将空载质粒pLEGFP-N1转化后小提。4.细胞培养：取出生第一天的C57鼠背部皮肤,剪为约0.5cm×0.5cm大小组织块,用0.1%中性蛋白酶4℃消化过夜。显微镊将表皮和真皮分离。将真皮剪碎,0.2%胶原酶37℃孵育30min左右,200目筛网过滤,收集细胞加入DMEM高糖培养基(含10%胎牛血清)培养,第3代细胞作为实验研究,将细胞分为2组：pLEGFP-N1组(对照组)和pLEGFP-N1-TERT组。5. QPCR检测：设空白对照,将两组细胞同时分别进行转染5h,更换含10%FBS的DMEM培养基,置培养箱中继续培养,转染24、36、48h后QPCR检测。6.氯化铯大提：将构建好的过表达载体pLEGFP-N1-TERT与空载pLEGFP-N1分别转化到STBL3感受态细胞中,加入Buffer II,上下颠倒混匀,冰上静置10min,充分裂解细菌；11gCscl及1mlEB(储备液浓度10mg/ml),待其充分溶解混匀后离心；DNA液中加入等体积的水饱和正丁醇(4ml左右)剧烈摇晃均匀,反复多次萃取；加入1ml的TE,在加入2.5倍体积的无水乙醇,室温静置,使乙醇充分溶解DNA上的Cscl提纯。7.病毒包装：制备质粒混合物于1.5ml EP中：ddH2O110μl,1M CaCl250μlPIK(包装质粒)20μg,2XHBS200μl, pLEGFP-Nl-TERT质粒20μg。混匀后室温放置15-20min。将质粒混合物均匀加入待转染293FT细胞皿中,轻轻摇动使混匀。37℃孵箱5-6h。弃掉培养基,PBS洗3次。换新鲜培养基,37℃孵育继续培养至48h。收集转染后72h的293FT细胞上清作为病毒液体,以0.45μm的滤器过滤,分装1.2ml/cryotube-80℃保存。pLEGFP-N1包装病毒方法相同。8.细胞感染与病毒滴度检测：用10ml无菌注射器吸取上清,后每3h收集一次,共3-4次。每次吸取上清以0.45μm的滤器过滤后感染细胞,感染时加入polybrene (2ug/ml)。病毒感染细胞后,G418筛选7天,得到稳定细胞株,扩增培养。测定病毒滴度。病毒滴度(PFU/ml)=GFP阳性细胞数×病毒稀释倍数/0.01ml。9.细胞生长曲线绘制：将typran染色>95%的细胞以104/孔密度接种于96孔细胞培养板,每孔体积200μl,各时间点均设3复孔。培养结束后加入5mg/ml MTT20μl/孔,37℃,5%CO2继续孵育4h,小心吸弃上清,加入DMSO150μl/孔,充分混匀,于Bio-Tek酶标仪分析492nm处OD值,绘制两组细胞生长曲线并比较。10.Western Blot检测：检测两组细胞TERT、BMP-4的表达情况。提取总蛋白,测定浓度后各取50μg蛋白,SDS-PAGE凝胶60V电泳1.5h后转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,5%脱脂奶37℃封闭1h,使用1：3000的稀释度稀释抗体,然后4℃孵育过夜；使用Goat anti-Mouse二抗1：6000孵育相应的膜,摇床缓慢摇动,室温120min;ECL试剂盒化学发光后曝光成像,同时检测β-actin(一抗1：500稀释)的表达作为内参。11.流式细胞仪检测：将typran染色>95%的细胞以106/孔种于12孔板。0.25%胰蛋白酶收集细胞。重悬细胞于含有1：50稀释的FITC-CD34和FITC-CD44抗体或1：20稀释的FITC-CD133抗体(以1：50稀释的mouse IgG/FITC作为对照),37℃,30min。流式细胞仪激发波长Ex=488nm；发射波长Em=530nm,检测阳性率。12.免疫组化：细胞于1×105接种于无菌盖玻片上,待细胞60%融合时,经PBS漂洗3次(每次5min),预冷丙酮固定10min,然后常规免疫细胞化学方法染色,检测versicar、TERT的表达情况,以PBS代替一抗作阴性对照。13.流式细胞周期：收集处理后的细胞,重悬后逐滴加入无水乙醇中4℃避光固定过夜,重悬细胞于500μl含100unit/ml的RNase A的PBS缓冲液中,避光37℃孵育30min。加2mg/ml PI至终浓度50μg/ml,避光37℃孵育30min。流式细胞仪激发波长488nm,发射波长525nm检测。14.移植表皮制备：受体裸鼠腹部皮肤,剪为约0.5cm×0.5cm大小组织块,用0.1%中性蛋白酶4℃消化过夜。PBS(含1%青、链霉素)漂洗3次,显微镊将表皮和真皮分离。将表皮剪碎,0.2%胶原酶37℃孵育30min左右直到所有组织被消化。15.细胞植入诱导：受体裸鼠麻醉成功后,常规消毒背部皮肤。将TERT稳定株细胞与对照组细胞分别与获得的表皮细胞重悬后,按1：1比例混合,调整细胞浓度为1×106/μL,以200μL为一单位,无菌条件下以将两组细胞悬液随机在裸鼠背部中线两侧作皮下注射。每三天观察体表毛发生长情况。21天后取材,按常规方法进行组织切片,荧光显微镜下观察诱导情况。结果：1. TERT基因的PCR扩增反应结束后,反应液进行琼脂糖凝胶电泳检测,获得3369bp大小的PCR片段,与目的基因大小相符。2.挑取菌落PCR鉴定出来的单克隆,摇菌,提取质粒后,用BamHI进行单酶切鉴定,获得约1800bp反应物,大小与理论一致,进一步表明TERT已经插入pLEGFP-N1载体中,送公司测序,测序结果正确。3. QPCR显示实验组TERT表达逐渐降低,并随着时间推移稳定存在。4.根据GFP数法进行滴度测定,测得逆转录病毒的滴度为1.0X109PFU/ml。转染后获得稳定细胞株接种后24h内贴壁,初为小圆形,细胞大小不均匀,核/浆比例较大。后逐渐伸展为短梭形及多角形和长梭形,荧光显微镜下可发绿色荧光。4d后形态呈成纤维细胞样,核椭圆形,较大,部分区域呈聚集性生长。原代培养的细胞9d即达70%-80%融合。5.细胞生长曲线显示：实验组细胞较对照组生长速度第二天后开始逐渐趋缓。6.流式细胞周期检测结果显示TERT高表达细胞进入G2/M期比例升高。7. Western Blot结果显示TERT高表达细胞株较对照组的TERT蛋白、BMP-4表达升高；流式细胞技术显示其CD44、CD133表达升高。组织化学染色显示其Versican、TERT表达升高。8.FCI后裸鼠体表观察：第2天观察裸鼠体表注射位置,伤口已合拢,注射时产生表皮隆起已吸收。后每3天观察裸鼠体表注射位置,移植部位3周后呈现轻微的隆起,可见色素沉着,翻开移植部位皮片,体视显微镜下可见皮下有大量毛发纤维生成。对照组有可见白色沉淀生成,未见明显色素沉着,移植3周后翻开移植部位,可见少量或无毛发纤维生成。9.组织取材切片后镜下观察TERT高表达细胞注射移植3周后,取移植部位组织切片染色。光镜下可见大量呈毛囊结构,其中心为嗜伊红染色的角化物质,向外依次为：内根鞘、外根鞘、真皮鞘。荧光显微镜观察显示发绿色光,证实其为注射细胞诱导出。对照组白色沉淀切片后可见类脂肪沉积物质。结论：本实验成功构建了逆转录病毒载pLEGFP-N1-TERT。该载体经检测结构稳定,将该载体转染293FT细胞,包装产生逆转录病毒,滴度高达1.0X109PFU/ml,且产生的病毒活性较高,感染效率高。感染新生鼠真皮细胞可在荧光显微镜下表达绿色荧光。Western Blot结果显示实验组细胞TERT蛋白、BMP-4蛋白表达明显高于对照组细胞,显示基因导入成功。经流式细胞仪检测细胞表面标记物CD44、CD133的表达明显增高提示实验组细胞的毛囊诱导能力提高。免疫组织细胞化学染色显示实验组Versican表达升高,提示其细胞粘附能力和凝聚性生长能力提高,这也更有利于真皮乳头的形成。将TERT高表达新生鼠真皮细胞移植于裸鼠皮下进行毛囊诱导,可见皮下有大量毛发纤维生成,组织切片检查证实其由移植细胞构成。该实验证实在合适条件下移植细胞可诱导毛囊生成,说明毛囊在适当的条件下可以重建,证实了FCI的理论基础,为临床上治疗提供了新方向。