论文部分内容阅读
MicroRNA(miRNA)是一类其长度约为20-24个核苷酸并且具有调节功能的非编码RNA。自从miRNA被发现以来,miRNA的功能作用和特异性表达等研究报道接踵而至,到如今miRNA已经被科学家鉴定为是参与各种生物生命活动的重要因子,包括细胞的增殖和分化、人类疾病的自身免疫以及生物与非生物胁迫等。MiR159基因家族是植物学领域中最古老,最保守的miRNA家族之一,其进化祖先能追溯到苔藓类。目前研究发现该家族包括三个成员,分别是miRl59a、miRl59b、miRl59c,其中最主要的成员是miRl59a和miRl59b。miR159主要的靶基因为MYB类转录因子,常见的有MYB33、MYB65、MYB97、MYB101等。MiR159基因家族功能丰富,不仅参与植物的营养生长、生殖生长,还参与生物和非生物胁迫。miR159靶基因MYB33的过表达导致叶片较小,叶柄较短,miR159a和miR159b功能缺失的突变体不能形成完整的花,miRl59b调控番茄种子发育等。虽然对miR159在多种植物中的功能有一定的研究,但对其在植物观赏性状发育中的作用研究不多。本实验拟运用基因敲除和超量表达的方法探究miR159在观赏植物矮牵牛中的功能,实验取得了以下研究成果:1.矮牵牛miRl59a和miRl59b基因敲除载体构建与转基因植株的获得利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,分别设计两个靶位点来构建miRl59a和miRl59b基因敲除载体,通过农杆菌侵染法转化矮牵牛,经过Basta筛选后得到了抗性株系,采用CTAB法提取抗性株系的DNA,进一步PCR、凝胶电泳检测观察发现有3个抗性株系的条带有片段缺失的现象,最后经测序鉴定,确认了3个发生片段缺失的miRl59b基因敲除突变体株系,分别命名为639-2,5,6(其中639-2与639-5的突变类型完全一致)。2.MiR159b基因敲除突变体的表型观察将基因敲除植株的组培苗移栽至田间管理,进行初步观察并收集种子,然后播种进而对Genome Editing 1(E1)代突变体进行表型观察和数据分析:miRl59b基因敲除突变体与野生型矮牵牛相比,叶片面积变大,株高变高,现蕾期的叶片数增多,开花时间略晚。提取植株花蕾总RNA并经荧光定量分析发现:MYB1在miRl59bE1代突变体中的表达量高于野生型,而MYB2在miRl59bE1代突变体中的表达量低于野生型。3.miRl59b超量表达载体的构建根据矮牵牛基因组设计miRl59b基因的引物序列miR159b-F/miRl59b-R,从野生型矮牵牛中克隆得到miRl59b基因,将目的基因与克隆载体pMD19-T连接构建中间载体,然后分别酶切pG605和miRl59b基因超量表达的中间载体,进而连接构建miRl59b超量表达载体,为进一步分析miRl59b基因的功能提供有利条件。