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一、小鼠IL-35的克隆及真核表达载体的构建目的：构建小鼠IL-35单链融合基因及其真核表达载体。方法：取小鼠脾细胞，体外LPS刺激6小时后提取总RNA，通过RT-PCR克隆小鼠EBI3和IL-12p35cDNA；采用重叠延伸PCR，通过编码疏水性多肽接头(Gly4Ser)3的DNA序列连接小鼠EBI3基因和IL-12p35成熟肽基因，构建小鼠IL-35单链融合基因，添加Igk信号肽及酶切位点，并将其克隆至pcDNA3.1（+）载体。通过酶切和测序鉴定阳性重组载体。结果：DNA序列分析结果表明：小鼠IL-35单链融合基因中EBI3、IL-12p35和linker的连接顺序、方向及序列完全正确。结论：成功构建了小鼠IL-35单链融合基因及其真核表达载体，为进一步探讨IL-35的生物学功能奠定了基础。二、IL-35抑制急性移植物抗宿主病的作用及作用机制目的：研究IL-35抑制急性移植物抗宿主病的作用及作用机制。方法：①建立C57BL/6→BALB/c小鼠清髓性异基因骨髓移植aGVHD模型。14只BALB/c小鼠经预处理后随机分为2组：实验组水流动力学注射IL-35质粒（HGT/IL-35）；对照组水流动力学注射空质粒（HGT/control）；各组小鼠于HGT后24小时分别接受Co~608.5Gy全身照射，照射4小时后尾静脉输注1×10~7个骨髓细胞+5×10~6个脾细胞建立急性移植物抗宿主病模型。移植后观察aGVHD表现，Log-rank检验各组生存率；移植后10d取肺、肝脏、回肠进行病理组织学检查，移植后10d嵌合度检测。②应用流式细胞仪检测移植后10d脾、肝、肺、小肠淋巴细胞CD3、CD4、CD8、CD44、CD62L、Gr1、CD19、NK1.1、CD11b、CD11c阳性细胞表达率；胞内染色检测移植后10d脾、肝、肺、小肠CD4+T淋巴细胞分泌IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ的比例及数量以及CD8+T淋巴细胞分泌IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ的比例及数量；流式CBA检测移植后第10天小鼠血清中的IL-10、IFNγ、TNFα、IL-6、IL-17水平。③流式细胞仪检测移植后10d脾、肝、肺、小肠CD4~+FoxP3~+T细胞、CD8~+FoxP3~+T细胞的比例及数量；BrdU掺入法检测移植后10d脾、肝、肺、小肠CD4~+、CD8+T细胞的增殖以及CD4~+FoxP3|~+T细胞、CD8~+FoxP3~+T细胞的增殖。④建立体外混合淋巴细胞反应（MLR）体系，以BALB/C鼠来源的脾细胞Co~6030Gy辐照后作为刺激细胞，以移植后10d2组小鼠脾细胞为反应细胞，培养3d，3~H掺入法检测H2~b脾细胞（反应细胞）的增殖效应；细胞毒性试验检测脾细胞对H-2~d抗原包被的肿瘤细胞CT-26的杀伤作用；CTLL-2细胞增殖实验检测脾细胞在H-2~d抗原刺激下所表达的IL-2水平。⑤建立小鼠移植物抗白血病模型，实验分3组：第一组：输注异基因骨髓细胞及带luciferaceA20（H-2~d）（1×10~6）；第二组：HGT/IL-35+输注异基因骨髓细胞+脾细胞及带luciferaceA20（H-2~d）（1×10~6）；第三组：HGT/control+输注异基因骨髓细胞+脾细胞及带luciferaceA20（H-2~d）（1×10~6）；每周在小动物活体成像仪上观察3组小鼠的体内肿瘤荧光，每2d给小鼠称重，观察小鼠生存，绘制生存曲线。⑥在小鼠急性移植物抗宿主病模型基础上，实验分4组：第一组：水流动力学注射IL-35质粒（HGT/IL-35）；第二组：水流动力学注射空质粒（HGT/control）；第三组：水流动力学注射IL-35质粒（HGT/IL-35），12小时后腹腔注射anti-IL-35抗体400μg，7d后腹腔注射anti-IL-35抗体200μg；第三组：水流动力学注射IL-35质粒（HGT/IL-35），12小时后腹腔注射IgG control抗体400μg，7d后腹腔注射IgG control抗体200μg；移植后观察小鼠aGVHD表现，每2d给小鼠称重，观察小鼠生存，绘制生存曲线。结果：①HGT/IL-35小鼠免疫组化在肝脏检测到IL-35的高效表达，HGT/control组小鼠出现中到重度的aGVHD表现，HGT/IL-35组小鼠GVHD程度轻，HGT/control组小鼠出现明显的肺部、肝脏和肠道病理改变。两组小鼠生存有明显统计学差异（P<0.0001）。②HGT/IL-35组小鼠B、Mφ、DC、Neu细胞比例及数量与HGT/control组比较有统计学差异（P<0.05）；HGT/IL-35组小鼠脾CD4+效应T细胞比例下降，与HGT/control组相比有统计学差异（P<0.05）；HGT/IL-35组小鼠CD3、CD4细胞比例高于HGT/control组（P<0.05）。③HGT/IL-35组小鼠脾、肝、肺、小肠CD4+T淋巴细胞分泌IFN-γ较HGT/control组明显下降（P<0.05）；脾、肺CD4+T淋巴细胞分泌TNF-α较HGT/control组明显下降（P<0.05）；肝、小肠CD4+T淋巴细胞分泌IL-17比例较HGT/control组明显下降（P<0.05）；肺CD4+T淋巴细胞分泌IL-17比例较HGT/control组明显升高（P<0.05）；HGT/IL-35组小鼠脾、肝、肺、小肠CD4+T淋巴细胞分泌IL-10较HGT/control组明显上升（P<0.05）。HGT/IL-35组小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-6含量较HGT/control组下降（P<0.05），而IL-10含量有明显上升（P<0.05）。IL-17血清浓度2组无统计学差异。④小鼠肺、肝、小肠CD4+FoxP3+T细胞比例HGT/IL-35组与HGT/control组比较有统计学差异（P<0.05）；脾、肺、肝CD8~+FoxP3~+T细胞比例HGT/IL-35组与HGT/control组比较有统计学差异（P<0.05）；肝、小肠CD4+BrdU+细胞比例HGT/IL-35组明显低于HGT/control组（P<0.05）；而CD8~-BrdU~-细胞比例二组间无统计学差异（P＞0.05）；肝、肺CD4~+FoxP3~+BrdU~+T细胞比例HGT/IL-35组明显高于HGT/control组（P<0.05）；脾、肺CD8~+FoxP3~+BrdU~+T细胞比例HGT/IL-35组明显高于HGT/control组（P<0.05）；⑤3H嵌入、细胞毒性实验、及IL-2水平的检测结果二组间有显著性差异（P<0.05）。⑥IL-35组小鼠在降低GVHD的同时并没有削弱GVL效应。⑦应用anti-IL-35抗体能阻断IL-35的免疫抑制作用，四组小鼠生存有统计学差异（P<0.05）。结论：IL-35能明显抑制GVHD的病理进程、明显改善生存率。其机制主要是通过抑制B、Mφ、DC、Neu细胞比例及数量，抑制CD4+T细胞分泌IFN-γ、TNF-α，抑制肝、小肠CD4+T细胞分泌IL-17，促进肺CD4+T细胞分泌IL-17，促进脾、肺、肝、小肠分泌IL-10，抑制CD4+T细胞增殖，促进Treg扩增等共同发挥作用，并且IL-35在抑制GVHD的同时并没有削弱GVL效应。三、Treg和Th17相关细胞因子在移植物抗宿主病中的作用研究目的：研究Treg细胞、Th17细胞及相关细胞因子在临床移植物抗宿主病患者中的作用。方法：2010年8月至2011年9月在苏州大学附属第一医院血液科接受异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）的76例患者中，男性46例、女性30例，中位年龄34（11～57）岁。实施同胞全相合异基因移植（allo-HSCT）患者44例，无关供者全相合外周血干细胞移植（MUD-PBSCT）22例，单倍型骨髓移植（HID-BMT）7例，脐血移植3例。流式细胞术检测GVHD发生时GVHD改善后外周血Treg细胞、Th17细胞比例，应用real-timePCR技术检测Th17相关细胞因子，应用ELISA检测血浆中IL-17、IL-23含量，分析与GVHD相关性。结果：所有患者均获造血重建，其中45(59.2%)例患者发生aGVHD，7(9.2%)例为cGVHD患者，45例aGVHD患者中，I°aGVHD12(26.7%)例；II°aGVHD16(35.5%)例；III°aGVHD5(11.1%)例；IV°aGVHD12(26.7%)例；aGVHD发生的中位时间为32(15-94)d。aGVHD（II°-IV°）患者Th17细胞比例及RORγt基因表达量明显高于aGVHD（O°-I°）患者及正常对照组。而Treg细胞比例及FoxP3基因表达量aGVHD（II°-IV°）患者明显低于aGVHD（O°-I°）患者及正常对照组。cGVHD患者FoxP3基因表达量低于正常对照组。aGVHD（II°-IV°）患者IL-6, IL-1β, IL-17,IL-21, IL-23和IL-23R基因表达量明显高于aGVHD（O°-I°）患者，而IL-22基因的检测结果则相反，aGVHD（II°-IV°）患者低于aGVHD（O°-I°）患者，cGVHD患者中IL-1β和IL-23明显升高。患者GVHD发生时Th17上升，Treg下降，血浆中IL-17，IL-23含量上升，GVHD改善后Th17下降，Treg上升，血浆中IL-17，IL-23含量下降。结论：异基因造血干细胞移植患者动态检测Th17细胞、Treg细胞及相关细胞因子，能早期预警GVHD发生，有望成为GVHD的临床监测指标。