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背景:膜联蛋白A5(Annexin A5,ANXA5),在多种组织中普遍表达。ANXA5异常表达与多种恶性肿瘤相关;与原位肝癌组织相比,ANXA5在肝门静脉瘤栓中高表达;在顺铂耐受的鼻咽癌细胞中也呈高表达。本课题组前期研究表明,ANXA5表达水平影响小鼠肝癌细胞(Hca-F/Hca-P)的增殖、迁移、侵袭等生物学功能,具有促进作用。本论文研究ANXA5影响人Hep G2生物学行为及机制研究。目的:1、构建pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA5表达载体,利用脂质体稳定转染至Hep G2中,筛选ANXA5表达稳定下调单克隆细胞株及对照细胞株;2、研究ANXA5对Hep G2体外增殖、迁移、侵袭、粘附、细胞骨架形成的影响及作用的分子机制;3、探究ANXA5对Hep G2细胞cisplatin耐受性的影响。方法:1、根据人源ANXA5的mRNA序列,设计特异性siRNA及无关序列,构建p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-ANXA5/NC表达载体;2、利用Lipofectamine TM 2000转染试剂转染重组质粒至Hep G2中,G418筛选及Western Blot验证获得ANXA5表达稳定下调单克隆细胞株及对照细胞株;3、MTT法联合平板克隆形成实验探究ANXA5对Hep G2体外增殖能力影响;4、Transwell小室法结合划痕实验探究ANXA5对Hep G2体外迁移、侵袭能力影响;5、与细胞外基质、内皮细胞以及小鼠淋巴结粘附实验探究ANXA5对Hep G2粘附能力影响;6、对微丝进行染色,探究ANXA5对Hep G2细胞骨架影响;7、MTT法结合Hoechst 33342染色法检测ANXA5对Hep G2顺铂(cisplatin)耐受性影响;8、Weatern Blot检测ERK信号通路关键分子、c-Myc表达变化;9、q RT-PCR检测E-Cadherin表达水平变化。结果:1、构建了p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-ANXA5/NC表达载体,获得ANXA5表达稳定下调单克隆Hep G2-sh ANXA5及阴性对照Hep G2-sh NC细胞株。与Hep G2-sh NC相比,Hep G2-sh ANXA5中ANXA5下调近100%;2、Hep G2-sh ANXA5较Hep G2-sh NC的增殖能力降低,平板克隆形成率降低24.7%;3、与Hep G2-sh NC相比,Hep G2-sh ANXA5迁移能力降低70.0%;4、Hep G2-sh ANXA5较Hep G2-sh NC侵袭能力降低85.0%;5、Hep G2-sh ANXA5较Hep G2-sh NC对细胞外基质、内皮细胞、小鼠淋巴结的粘附能力分别降低10.2%、30.2%、48.0%;6、ANXA5下调后,Hep G2细胞actin骨架染色变浅,F-actin结构性降低排列紊乱;7、Hep G2-sh ANXA5较Hep G2-sh NC对cisplatin敏感性明显降低;8、与Hep G2-sh NC相比,Hep G2-sh ANXA5中Raf、MEK1/2、ERK2的磷酸化水平降低,c-Myc蛋白水平降低,E-Cadherin m RNA水平升高。结论:1、筛选获得ANXA5表达稳定下调及对照单克隆细胞株;2、ANXA5下调抑制了Hep G2体外增殖能力;3、ANXA5下调抑制了Hep G2体外迁移、侵袭、黏附、细胞骨架形成能力;4、ANXA5下调可能通过ERK信号通路调控Hep G2的增殖、转移能力;5、ANXA5下调增强Hep G2对cisplatin的耐受性。