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[目的] p33ING1b基因是一个新近克隆的肿瘤抑制基因,在人类多种肿瘤中存在该基因结构与表达的异常。本研究选取 p33ING1b基因低表达的人结肠癌 SW480细胞系做为研究对象,将外源性p33ING1b基因转染入SW480细胞系,研究p33ING1b基因高表达对SW480细胞系生长增殖的影响,并探讨其作用的可能分子机制。 [方法]将pcDNA3.1(+)/p33ING1b真核表达载体,采用阳离子脂质体转染技术,转染人结肠癌SW480细胞系,G418筛选,挑选阳性克隆,经RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学鉴定阳性克隆,扩大培养阳性克隆细胞,通过生长曲线绘制和软琼脂集落形成实验,检测pcDNA3.1(+)/p33ING1b/SW480、pcDNA3.1(+)/SW480以及SW480三组细胞的增殖速度,用流式细胞仪分析三组细胞的细胞周期改变和凋亡率,阐明p33ING1b基因高表达对SW480细胞系的影响。并用Western blot方法,检测三组细胞p53、p21WAF1、Bax及Bcl-2蛋白的表达情况,探讨p33ING1b基因抑瘤的可能分子机制。 [结果]重组质粒DNA经酶切和测序鉴定,结果均证实pcDNA3.1(+)/p33ING1b真核表达载体构建成功。采用阳离子脂质体将 pcDNA3.1(+)/p33ING1b和pcDNA3.1(+)转入SW480细胞,G418筛选的阳性克隆细胞,经RT-PCR、SP免疫细胞化学及Western blot方法检测,鉴定结果显示,高表达 p33ING1b蛋白质的SW480细胞系成功建立。细胞生长曲线结果表明,在 SW480细胞中高表达 p33ING1b蛋白的转染组,与未转染组和转空载体组相比,细胞生长增殖速度减慢(P<0.05);软琼脂克隆形成实验结果显示, pcDNA3.1(+)/p33ING1b/SW480细胞形成的集落率为(9.8±2.1)％,而pcDNA3.1(+)/SW480细胞和SW480细胞的集落形成率分别为(21±3.1)%和(23±2.6)%,转基因组细胞集落形成率明显低于转空载体组和未转染组,差异有统计学意义(P<0.01)。进一步采用流式细胞仪检测 p33ING1b基因对 SW480细胞周期及凋亡的影响,研究结果显示:pcDNA3.1(+)/p33ING1b/SW480组细胞凋亡率为15.4±1.7%,而SW480细胞和pcDNA3.1(+)/SW480细胞的凋亡率,分别为1.6±0.8%和2.0±0.6%,转基因组细胞凋亡率高于转空白载体组和未转染组,差异具有显著性意义(P<0.05),而对细胞周期的改变不明显(P>0.05)。结果提示,p33ING1b基因在SW480细胞中高表达,能有效抑制SW480细胞的生长,并促进其凋亡。为了进一步探讨p33ING1b基因对SW480细胞生长抑制作用机制,我们采用Western blot的方法,分析P33ING1b蛋白高表达后,P53、P21WAF1、Bax及Bcl-2蛋白表达水平的变化。结果表明,在SW480细胞中,p33ING1b基因的高表达,导致Bax蛋白质的表达水平升高、Bcl-2蛋白质表达水平降低,差异有显著性意义(P<0.05);p53及p21WAF1蛋白质表达水平稍有升高,但差异无显著性意义(P>0.05)。 [结论] 1.构建pcDNA3.1(+)/p33ING1b真核表达载体。 2.成功建立pcDNA3.1(+)/p33ING1b/ SW480细胞系,并稳定高表达p33ING1b蛋白质。 3.高表达外源性p33ING1b基因后, SW480细胞生长增殖速度减慢,凋亡增加,其机制可能与Bax蛋白质表达上调、Bcl-2蛋白质表达下调有关。