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研究背景:继发性心脏损伤（Trauma-induced secondary cardiac injury,TISCI）是在机体遭受未直接作用于心脏的创伤（如跌落伤、撞伤、组织撕裂伤等）后一段时间内心脏功能发生障碍的一类疾病,表现为心律失常、室颤、心脏骤停等。该病起病隐匿,极易漏诊,因此对此病的具体发病机制进行研究显得尤为重要。研究证实心肌凋亡是继发性心脏损伤导致心脏功能下降的主要原因。课题组已有的研究发现引起凋亡的三条半胱胺酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）途径中,介导内质网应激（Endoplasmic,reticulum stress,ERS）凋亡途径的caspase-12激活最早。caspase-12是ERS的下游分子,其活性和表达受到ERS伴侣分子葡萄糖调节蛋白78（Glucoseregulated protein 78,GRP78）的调控。本课题组前期发现创伤后GRP78蛋白表达升高,但是调控GRP78表达和功能的机制尚不明确。本研究通过观察创伤早期心肌细胞中蛋白质精氨酸甲基转移酶1（Protein arginine methyltransferase 1,PRMT1）表达和功能的改变,以探讨其调控创伤后心肌细胞GRP78功能的分子机制,及其在caspase-12早期激活中的作用。目的:1.在体水平观察创伤大鼠心肌组织PRMT1的时间变化情况,探讨其与GRP78表达的关系。2.离体水平进一步分析PRMT1对创伤后心肌细胞GRP78功能的影响,并对其作用机制进行初步探索。方法:1.在体水平:将SD雄性大鼠随机分为伪创伤组和创伤组（创伤组包括5个组,分别为创伤后0 h,3 h,6 h,12 h,24 h,每组6只,共36只）。使用Noble-Collip创伤仪制备创伤大鼠模型。（1）使用活性测定试剂盒检测大鼠心肌组织caspase-12活化水平。（2）通过Western Blot检测大鼠心肌组织caspase-12、GRP78、PRMT1、H4R3me2a蛋白表达情况。（3）通过Quantitative Real-time PCR（RT-qPCR）检测大鼠心肌组织GRP78的m RNA水平。2.离体水平:（1）使用胎牛血清以及创伤后心肌组织GRP78表达最高时间点的血清配置不同培养基来制备细胞模型,以胎牛血清组作为对照（Sham）组,创伤大鼠血清作为实验组（分别培养H9C2心肌细胞1 h,3 h,6 h,12 h,24 h）。1)使用活性测定试剂盒检测H9C2心肌细胞caspase-12活化水平2)通过Western Blot检测H9C2心肌细胞caspase-12、GRP78、PRMT1蛋白表达情况。3)通过RT-qPCR检测H9C2心肌细胞GRP78的m RNA水平。（2）使用PRMT1 siRNA转染H9C2心肌细胞,分为胎牛血清（Sham）组、创伤大鼠血清（Blank）组、创伤大鼠血清+PRMT1 siRNA（PRMT1沉默）组、创伤大鼠血清+NC RNA（阴性对照）组。1)通过Western Blot检测各组H9C2心肌细胞PRMT1蛋白表达情况。2)通过Western Blot检测各组H9C2心肌细胞GRP78蛋白表达情况。3)使用活性测定试剂盒检测各组H9C2心肌细胞caspase-12活化水平;通过Western Blot检测各组H9C2心肌细胞caspase-12蛋白表达情况。3.通过蛋白质免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）检测GPR78的精氨酸不对称双甲基化修饰（asymmetric dimethylation of arginine,ADMA）情况。结果:1.创伤大鼠心肌组织caspase-12活性增强,caspase-12、GRP78、PRMT1蛋白表达升高。1.1创伤大鼠心肌组织caspase-12活性增强,蛋白表达升高。Caspase-12活性测定试剂盒检测结果表明,与Sham组相比,创伤后大鼠心肌组织caspase-12活性在3 h开始增强（P＜0.05）,6 h达到峰值（P＜0.05）。Western Blot结果表明,创伤后3 h大鼠心肌组织caspase-12蛋白表达开始升高（P＜0.05）,6 h达到峰值（P＜0.05）。1.2创伤大鼠心肌组织GRP78表达升高。Western Blot结果表明,与Sham组相比,创伤后大鼠心肌组织GRP78蛋白表达在3 h开始明显升高（P＜0.05）,6 h达到峰值（P＜0.01）,12 h仍维持高水平表达（P＜0.05）。RT-qPCR结果表明,与Sham组相比,创伤后大鼠心肌组织GRP78的m RNA表达0 h开始升高（P＜0.05）,在3 h达到峰值（P＜0.01）,在6 h仍维持高水平表达（P＜0.05）。1.3创伤大鼠心肌组织PRMT1、H4R3me2a蛋白表达升高。Western Blot结果表明,与Sham组相比,创伤后大鼠心肌组织PRMT1蛋白表达在3 h开始明显升高（P＜0.05）,6 h达到峰值（P＜0.01）,6 h之后维持高水平表达（P＜0.05）。创伤后大鼠心肌组织H4R3me2a蛋白表达在3 h开始升高（P＜0.05）,6 h达到峰值（P＜0.01）,6 h之后维持高水平表达（P＜0.05）。1.4创伤大鼠心肌组织GRP78和PRMT1表达的改变存在正相关。相关性分析结果显示,创伤后大鼠心肌组织中GRP78和PRMT1蛋白表达的改变存在一定相关性（r=0.7487,P＜0.0001）。2.创伤时可能通过上调心肌细胞PRMT1蛋白表达,进而增加GRP78的表达,并导致caspase-12蛋白的早期激活。2.1创伤血清导致H9C2心肌细胞capase-12活性增强,蛋白表达升高。Caspase-12活性试剂盒检测结果表明,与Sham组相比,H9C2心肌细胞中caspase-12活性在3 h开始增强（P＜0.05）,6 h达到峰值（P＜0.05）。Western Blot结果表明,与Sham组相比,H9C2心肌细胞中caspase-12蛋白表达3 h开始升高（P＜0.05）,6 h达到峰值（P＜0.05）。2.2创伤血清导致H9C2心肌细胞GRP78表达升高。Western Blot结果表明,与Sham组相比,使用创伤血清培养的H9C2心肌细胞GRP78蛋白表达在3 h开始升高（P＜0.05）,6 h达到峰值（P＜0.01）,12 h仍维持高水平表达（P＜0.05）。RT-qPCR结果表明,与Sham组相比,H9C2心肌细胞中GRP78的m RNA表达在3 h开始升高（P＜0.05）,3 h之后维持高水平表达（P＜0.05）。2.3创伤血清导致H9C2心肌细胞PRMT1表达升高。Western Blot结果表明,与Sham组相比,使用创伤血清培养的H9C2心肌细胞PRMT1蛋白表达在3 h开始升高（P＜0.05）,6 h达到峰值（P＜0.01）,12 h仍维持高水平表达（P＜0.01）。2.4沉默PRMT1后使用创伤血清培养的H9C2心肌细胞PRMT1表达降低。Western Blot结果表明,与Blank组相比,沉默PRMT1基因后H9C2心肌细胞PRMT1蛋白表达降低（P＜0.05）。2.5沉默PRMT1后使用创伤血清培养的H9C2心肌细胞GRP78表达升高Western Blot结果表明,与Blank组相比沉默PRMT1基因后H9C2心肌细胞GRP78蛋白表达升高（P＜0.05）。2.6沉默PRMT1后使用创伤血清培养的H9C2心肌细胞capase-12活性减弱、表达降低Western Blot结果表明,与Blank组相比沉默PRMT1基因后H9C2心肌细胞capase-12活性降低（P＜0.05）。2.7 GRP78蛋白存在精氨酸不对称双甲基化修饰。Co-IP结果表明,GRP78蛋白存在精氨酸不对称双甲基化修饰。结论:创伤早期大鼠心肌细胞发生内质网应激性凋亡,其可能机制是通过PRMT1增加GRP78的精氨酸甲基化修饰来实现的。