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背景:新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)是一种环境来源致病真菌,主要感染免疫缺陷型患者。它的生存环境多样,包括桉树、鸟粪、动物毛皮等坏境。人类通过呼吸将其孢子吸入体内,当机体发生免疫缺陷时,它随着血液循环最终突破血脑屏障导致严重的隐球菌脑膜炎。新生隐球菌每年导致超过100万的病例,和超过60万人死亡,致死率超过50%,严重威胁公众的生命安全。目前,临床上治疗隐球菌病的药物主要有:多烯类药物两性霉素,唑类药物氟康唑,核酸抑制剂类药物5-氟胞嘧。由于真菌感染常需要长期治疗,而长期使用两性霉素B会对宿主细胞产生严重毒副作用,长期使用氟康唑和5-氟胞嘧啶容易产生耐药菌株,这些都加大了治疗新生隐球菌感染的难度。因此,开发新的有效治疗药物迫在眉睫。小檗碱具有广泛的药理作用,能有效地治疗腹痛和腹泻,并具有抗炎、抗癌、提高原发性和继发性血小板减少症患者的血小板数等作用。此外,它还对热带假丝酵母、白色念珠菌和新生隐球菌等致病真菌具有抗菌活性,但作用机制尚不明确。研究小檗碱对新生隐球菌的抗菌机制,可为隐球菌病的治疗提供理论依据,为寻找新的抗真菌药物奠定基础。目的:本文旨在研究小檗碱对新生隐球菌的抗菌机制,以及小檗碱对新生隐球菌主要毒力因子荚膜、黑色素和温度的影响,为解析小檗碱的抗真菌机制和真菌感染的治疗提供重要依据。方法:1.通过肉汤稀释法确定小檗碱是否对新生隐球菌有抑制效果。2.用棋盘法检测小檗碱与已有治疗新生隐球菌的药物氟康唑、5-氟胞嘧啶、两性霉素B联合用药是否有协同效果。3.将新生隐球菌分别培养于含同等MIC倍数的小檗碱及氟康唑的RPMI 1640中,每隔12h取出培养后的菌液涂至YPD平板,通过平板中长出的菌落数判断小檗碱对新生隐球菌是抑菌效果还是杀菌效果。4.将新生隐球菌分别培养于DMEM、Neeger Seed、MS培养基上,在这些培养基中均添加小檗碱,以检测小檗碱对新生隐球菌荚膜、黑色素及有性生殖的影响。对于小檗碱对新生隐球菌温度的影响,则将新生隐球菌加入含小檗碱的RPMI 1640培养基中,并分别培养于30℃/37℃摇床,每隔12h取出培养后的菌液涂至YPD平板,通过平板中长出的菌落数判断小檗碱对新生隐球菌温度的影响。5.为研究小檗碱通过何种机制影响新生隐球菌的生长及主要毒力因子,首先通过RNA-Seq找出在小檗碱中转录水平下调的基因MLN1,用Split Marker法,利用基因枪构建MLN1基因敲除株mln1△,检测mln1△突变株在含有小檗碱的培养基中的生长状态,并检测mln1△突变株的荚膜大小、合成黑色素能力、有性生殖情况。6.为研究小檗碱是通过cAMP途径抑制新生隐球菌的生长,还是通过其他途径发挥抗菌活性,用Split Marker法,利用基因枪构建cAMP途径中的NRG1基因敲除株nrg1△,并检测nrg1△及cAMP途径中的PKA1、HOG1基因敲除株pka1△、hog1△在含有小檗碱的培养基中的生长状态。7.为研究小檗碱通过何种机制对新生隐球菌发挥抗菌活性,分别检测WT+DMSO、WT+BBR、nrg1△+DMSO、nrg1△+BBR中新生隐球菌的基因转录组,利用生物信息学分析,研究转录水平变化。结果:1.小檗碱能抑制实验室标准菌株和临床分离株,包括耐药株,最低抑菌浓度(MIC)为8-16μg/mL。小檗碱对新生隐球菌为杀菌效果。2.小檗碱与氟康唑、5-氟胞嘧啶、两性霉素B联合使用能以更低浓度的药物抑制新生隐球菌的生长,但没有协同效果。3.小檗碱抑制新生隐球菌的荚膜大小、产黑色素能力和有性生殖,小檗碱在30℃与37℃均能抑制新生隐球菌的生长,但其抑制效果在30℃与37℃没有明显差异。4.构建了MLN1缺失突变株,发现缺失MLN1不改变小檗碱对新生隐球菌生长的影响,且mln1△突变株产荚膜与黑色素能力与野生型无异,仅有性生殖有轻微缺陷。5.构建了NRG1缺失突变株,构建了NRG1互补载体P1011和NRG1过表达载体P1009,用基因枪分别将载体P1011转入突变株nrg1△,载体P1009转入野生型菌株,成功获得了NRG1互补菌株、NRG1过表达菌株。6.nrg1△突变株荚膜变小、黑色素合成受到抑制以及表现出明显的有性生殖缺陷,并且nrg1△突变株对小檗碱敏感,即在含小檗碱的培养基中,nrg1△突变株生长受到强烈抑制。7.RNA-Seq数据表明,WT+BBR中转录水平发生改变的基因较少,且几乎都为未知功能,nrg1△+BBR中转录水平发生改变的已知功能基因大多集中为参与代谢过程、跨膜转运、氧化还原过程、蛋白质磷酸化、DNA复制和修复、转录、微管细胞骨架组织/微管核及信号转导,且nrg1△+BBR中仅转录水平下调的基因参与新生隐球菌毒力。结论:小檗碱不仅对新生隐球菌具有杀菌效果,还能显著抑制新生隐球菌的有性生殖、荚膜大小以及产黑色素能力。小檗碱通过隐球菌环境感受的关键转录因子NRG1发挥抗菌和影响重要毒力因子的表达,并且可能通过cAMP途径外的其它机制。本研究为阐明小檗碱抗菌的分子机制及其作为治疗隐球菌病的候选药物奠定基础。