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背景肠道是人体重要的消化器官,也是人体最大的排毒器官。在肠道疾病中,溃疡性结肠炎是一种病因尚不清的结肠和直肠慢性非特异性炎症性疾病,病变多局限于结肠粘膜及粘膜下层,病位多见于乙状结肠和直肠,也可延伸至整个结肠。肠道是由不断变化的肠道上皮细胞组成的。发育中的肠道上皮细胞（IECs）分化为7种不同类型的高度特化细胞,协同吸收营养,调节肠道蠕动,维持粘膜屏障。上皮绒毛只含有非增殖和分化的细胞,比如肠上皮细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞和tuft细胞等。Tuft细胞是肠道上皮中一类形状像刷子（brush）的上皮细胞,其数量约占整个小肠上皮细胞的0.5%。Tuft细胞在肠道中可以促进肠道上皮细胞的增生,增强肠道上皮完整性;在蠕虫感染时,tuft细胞引发2型免疫反应诱发肠道上皮重塑。哺乳动物中Sirtuins家族的重要成员Sirtuin 6（SIRT6）参与调控代谢、衰老、炎症等多种生理功能。SIRT6作用于溃疡性结肠炎的研究已有相关报道,但机制还未清楚,而SIRT6在肠道tuft细胞中的作用和机制研究目前无相关报道。目的本研究采用基因敲除的Cre-loxp系统来建立在肠道上皮中敲除Sirt6基因(Sirt6f/f:Villin-cre)的小鼠模型,研究SIRT6在肠道上皮细胞中的作用;同时利用全身性过表达SIRT6的转基因（TgSIRT6）小鼠模型,研究SIRT6在肠道上皮细胞中过表达后是否直接作用于肠道上皮细胞。本项目的完成,将为炎症性肠病和寄生虫感染的预防和治疗提供新的理论基础。方法1.研究SIRT6在溃疡性结肠炎中的作用（1）利用正常蒸馏水和含有2.5%DSS的蒸馏水喂养野生型小鼠（Wild-type,WT）,建立慢性溃疡性结肠炎模型,通过Western Blot和qRT-PCR方法检测在溃疡性结肠炎小鼠结肠组织和正常小鼠结肠组织中SIRT6的表达。（2）采用Villin-cre小鼠和Sirt6 floxed(Sirt6flox/flox)小鼠交配繁殖,得到Sirt6f/f:Villin-cre（Sirt6-IKO）小鼠,即肠道上皮细胞特异性敲除Sirt6基因的小鼠。通过Western Blot和qRT-PCR方法检测SIRT6在肠道上皮细胞中被有效敲除,选用SIRT6在肠道上皮细胞中有效敲除的小鼠,即Sirt6-IKO进行研究。（3）采用含有2.5%DSS的蒸馏水长期间断性喂养WT（Ctrl）小鼠和Sirt6-IKO小鼠,3个月后牺牲小鼠收集血清,取小鼠结肠组织进行表型分析;提取两组小鼠结肠组织（Colon）的总RNA,检测两组小鼠结肠组织中促炎症因子IL6、TNFa的表达水平。2.研究SIRT6在肠道tuft细胞分化中的作用和机制研究（1）采用WT（Ctrl）小鼠和Sirt6-IKO小鼠进行研究,检测SIRT6是否影响肠道tuft细胞的发育分化。（2）根据H.polygyrus寄生虫的生长曲线灌胃WT小鼠得到寄生虫感染0天、7天、11天、15天四组不同天数寄生虫感染小鼠,检测蠕虫感染肠道后,tuft细胞启动的2型免疫反应对于肠道蠕虫的驱除有重要作用,并且肠道上皮细胞内STAT6的磷酸化水平与肠道上皮细胞内总体的SIRT6水平呈正相关。（3）10只8周龄雄性WT（Ctrl）小鼠和10只8周龄雄性Sirt6-IKO小鼠,体重均等,每只小鼠采用200条H.polygyrus的L3幼虫以灌胃方式感染小鼠,15天后牺牲小鼠进行表型分析,检测蠕虫感染后SIRT6是否对tuft细胞增生并启动2型免疫反应对肠道蠕虫的清除起到了一定的调节作用。（4）采用WT（Ctrl）小鼠和全身性过表达SIRT6的转基因小鼠（TgSIRT6）,检测SIRT6在肠道上皮细胞过表达是否可以影响肠道tuft细胞的发育分化。（5）采用培养（Ctrl）小鼠和Sirt6-IKO小鼠的空肠隐窝类器官（Organoid）检测肠道上皮细胞SIRT6是否直接调控tuft细胞的分化,并降低STAT6的磷酸化水平。通过IL-13（10ng/ml,2h）刺激类器官检测IL-13是否上调细胞中的SIRT6水平,从而增加STAT6的磷酸化水平。（6）采用Luciferase assay方法和CO-IP方法检测SIRT6是否调控STAT6的转录活性并改变STAT6的乙酰基化水平。结果1.SITR6在溃疡性结肠炎中的表达及作用研究（1）2.5%DSS长期喂养的小鼠与正常蒸馏水喂养的小鼠相比,结肠组织中SIRT6在mRNA水平和蛋白水平上的表达下降（P<0.05）;（2）2.5%DSS长期喂养WT（Ctrl）、Sirt6-IKO小鼠（10只/组）,表型分析结果显示:Sirt6-IKO小鼠从体重、DAI评分方面表现出更严重的溃疡性结肠炎表型（P<0.05）;（3）2.5%DSS长期喂养WT（Ctrl）、Sirt6-IKO小鼠（10只/组）,免疫组化结果和HE染色结果显示:Sirt6-IKO小鼠结肠组织巨噬细胞浸润程度以及病理评分更高（P<0.05）;（4）2.5%DSS长期喂养WT（Ctrl）、Sirt6-IKO小鼠（10只/组）,结肠组织qRT-PCR结果表明:Sirt6-IKO小鼠结肠组织中的促炎症因子较WT（Ctrl）小鼠高（P<0.05）。2.SIRT6在肠道tuft细胞分化中的作用及研究机制（1）肠道上皮细胞SIRT6的缺失导致肠道tuft细胞数量明显减少（P<0.05）;（2）SIRT6的表达和STAT6的磷酸化水平随着寄生虫感染不同天数tuft细胞的增加而升高（P<0.05）;（3）寄生虫感染后的WT（Ctrl）小鼠空肠中DCLK1的表达水平明显增加时,而Sirt6-IKO小鼠空肠中DCLK1的表达水平无明显变化（P<0.05）;（4）肠道上皮细胞SIRT6过表达后肠道tuft细胞数量没有明显变化（P>0.1）;（5）肠道上皮细胞SIRT6直接调控tuft细胞分化并影响STAT6的磷酸化水平;（6）SIRT6和STAT6有相互作用并调控STAT6的活性,但SIRT6并不改变STAT6的乙酰基化水平。结论1.肠道上皮细胞SIRT6缺失增加溃疡性结肠炎的易感性。2.肠道上皮细胞中缺失SIRT6会显著减少tuft细胞的数量,从而损害蠕虫感染后由2型免疫反应介导的肠道上皮重塑。