紫花针茅SpCBLs和SpCIPKs响应非生物胁迫的功能研究

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植物体中Ca2+信号是植物生长调节和环境适应过程中的重要传感器和调节器,这种Ca2+信号能被非生物胁迫刺激而发生时空变化。CBL(calcineurin B-likeproteins)及其互作蛋白CIPK(CBL-interacting protein kinase)是已经确立的能够解码并传递Ca2+信号至胁迫响应元件的重要组分。紫花针茅是青藏高原高寒草原的建群种,也是青藏高原重要的牧草之一,在维系高原生态系统的稳定性和促进高原草畜牧业发展等方面具有重要作用。然而到目前为止,对紫花针茅CBL和C1PK的研究还未见报道。基于前期紫花针茅转录组测序获得的EST序列,本文利用RACE技术从紫花针茅中克隆了5个CBL基因,4个CIPK基因。序列分析之后,这些基因用于拟南芥异源表达以探究其生物学功能,主要结果总结如下:  (1)紫花针茅SpCBL氨基酸序列同其他物种CBL氨基酸序列类似,具有4个典型的EF手型结构域。分布于3个不同的分支上。其中SpCBL2与SpCBL3序列相似度高达93.3%,可能是近期复制的结果。紫花针茅SpCIPK是一类典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,其N端都含有一个保守的蛋白激酶结构域,C端都含有NAF结构域。SpCIPK1和SpCIPK3聚在同一分支,SpCIPK10和SpCIPK26聚在另一分支内。  (2)紫花针茅SpCBL6长度为681bp,编码一个含226个氨基酸的多肽,其表达能被干旱和冷胁迫所诱导。激光共聚焦显微镜分析发现SpCBL6蛋白定位于质膜上;转基因材料研究发现:与野生型相比,SpCBL6转基因拟南芥植株对冷冻胁迫具有更强的耐受性,但对干旱胁迫无明显耐性。qRT-PCR分析表明:SpCBL6转基因拟南芥中干旱胁迫标记基因表达被抑制,而冷胁迫标记基因表达量升高。并且SpCBL6过表达提高了冷冻处理下植物水势、光合效率(Fv/Fm),降低了冷处理下植物的离子渗漏量,这些结果表明SpCBL6可能通过渗透调节和维持细胞膜的稳定性来提高植物耐冻性。  (3)在拟南芥中过表达SpCIPK26能够增加植物对干旱和盐胁迫的耐受性。干旱和盐胁迫处理下,SpCIPK26过表达植株的水势和Fv/Fm都显著提高,而ROS积累量明显降低。而外源施加钨酸钠(WS,一种ABA抑制剂)削弱了SpCIPK26转基因拟南芥植株对干旱和盐胁迫的耐受性,表明ABA对SpCIPK26的正向调节作用。干旱和盐胁迫条件下,SpCIPK26转基因拟南芥中胁迫诱导基因(RD29A,RD29B和ABF2)和ROS清除基因(CAT1)的表达量上调,ABA处理下呈现出相似的上升表达模式,且这些基因的启动子区都有ABA响应结合元件。以上结果说明SpCIPK26可能通过依赖于ABA的信号通路提高拟南芥对干旱和盐胁迫的耐受性。  (4)将pRI-101GFP-SpCIPK3载体用于花序法侵染野生型(Col-0)和cipk3突变体拟南芥。功能分析表明,SpCIPK3过表达回复了cipk3突变体对冷胁迫的耐受性。利用遗传学分析表明两个冷胁迫标记基因(CBF3和COR15a)的表达受SpCIPK3调节。利用酵母双杂交方法(Y2H)筛选到了SpCIPK3的4个SpCBL互作子,其中3个SpCBL在紫花针茅中的表达被冷胁迫所诱导。在冷胁迫条件下,SpCBL2转基因拟南芥与SpCIPK3过表达拟南芥呈现出相似的表型,暗示SpCBL2/SpCIPK3复合物可能参与冷胁迫响应通路。鉴于CBL/CIPK在信号转导中的重要作用,以上结果为农作物分子育种和选育高抗逆品种提供了科学依据。
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