口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的偶蹄类动物多发的一种急性、热性和传播极为迅速的接触性传染病，国际兽疫局将该病列为Ａ类家畜传染病之首,并列入世界范围内重要传染病研究行列。该病的病原体为口蹄疫病毒，属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属。共包括A，O，C，南非（SAT）I，II，III和亚洲I型等7个血清型及65种以上的亚型。我国口蹄疫病毒血清型以O型为主。目前传统的防治措施是对病畜进行捕杀或对易感动物接种灭活疫苗进行预防。但病毒灭活不彻底时,残留的活病毒会引起新的疫情。因此比较有发展前途的疫苗是基因工程疫苗。凝血因子X（FX）是一种常用的基因工程蛋白酶，可以用于融合蛋白的切割，从而使天然蛋白质从融合蛋白中释放出来。具有活性的FX（FXa）识别由四个氨基酸组成的序列：Ile-Glu-Gly-Arg。我们针对O型口蹄疫病毒，利用基因工程技术构建了两种基因工程蛋白疫苗；同时构建表达了凝血因子X作为工具酶用于日常工作。本工作主要包括以下两部分：一、抗O型口蹄疫病毒重组蛋白疫苗的研制1. VP1-SFTepi重组蛋白的研制1.1 VP1-SFTepi重组蛋白表达载体的构建 <WP=55>根据O型口蹄疫病毒VP1的基因序列，结合已报导的VP1中的B细胞表位和T细胞表位信息，同时采用了所查找到的来源于猪瘟病毒T细胞表位，利用PCR方法获得了编码部分VP1的基因片段和猪瘟病毒T表位（SFTepi）基因片段。将两个片段进行与pET28a质粒连接，构建了pET28-VP1-SFTepi表达载体。1.2 VP1-SFTepi重组蛋白在大肠杆菌中表达和纯化将所构建的重组质粒转化BL21（DE3）大肠杆菌，使用IPTG诱导重组蛋白的表达，通过SDS-PAGE分析显示，目的蛋白在BL21(DE3)中得到了高效表达。用金属螯合层析纯化获得纯化的重组蛋白，经SDS-PAGE分析发现：重组蛋白除单体外，还有二聚体和多聚体。1.3 VP1-SFTepi重组蛋白的抗病毒活性用VP1-SFTepi重组蛋白免疫豚鼠后得到免疫血清，并利用此免疫血清中和100LD50的猪O型口蹄疫病毒，利用乳鼠中和试验检测重组蛋白抗体的中和病毒活性，结果显示：我们构建的VP1-SFTepi重组蛋白不能有效地中和猪O型口蹄疫病毒的活性。其原因可能为：原核细胞表达的蛋白质结构与VP1蛋白不同，不能刺激机体产生中和抗体；也可能与蛋白质形成多聚体掩盖VP1蛋白中B细胞表位所致。为了能更好地使VP1上的B细胞表位发挥作用，我们又构建了多表位重组蛋白。2. poly-VP1epi重组蛋白的研制2.1 poly-VP1epi重组蛋白表达载体的构建根据O型口蹄疫病毒VP1的氨基酸序列，查到三个重要的抗原表位序列：B细胞表位和两个T细胞表位序列。进而合成十条特异引物，利用PCR及克隆方法获得VP1多表位（poly-VP1epi）基因片段，将poly-VP1epi基因片段与pET28a质粒相连接，构建了poly-VP1epi重组蛋白表达载体。2.2 poly-VP1epi重组蛋白体在大肠杆菌中表达和纯化 <WP=56>将所构建的重组质粒转化BL21（DE3）大肠杆菌，用IPTG诱导重组蛋白的表达，通过SDS-PAGE鉴定表达产物，结果显示：目的蛋白在BL21(DE3)中得到了高效表达。采用金属螯合层析方法对重组蛋白进行了纯化。2.3 poly-VP1epi重组蛋白的抗病毒活性测定用poly-VP1epi重组蛋白免疫豚鼠后得到免疫血清，并利用此免疫血清中和100LD50的猪O型口蹄疫病毒，利用乳鼠中和试验检测重组蛋白抗体的中和病毒活性，结果显示：我们构建的poly-VP1epi重组蛋白有部分中和猪O型口蹄疫病毒的活性。说明多表位重组蛋白由于表位的不断重复排列，可以使B细胞表位有机会暴露在蛋白分子的表面，如果在此研究基础上，对蛋白质结构进一步优化改造，很可能构建出更有效的蛋白类疫苗。另外，对免疫方式、免疫途径和免疫佐剂的选择可能也是免疫成功的重要因素。二、重组凝血因子X融合蛋白的构建和表达表达重组凝血因子X的主要目的是获得实验室所需的工具蛋白酶。我们采用RT-PCR方法从小鼠肝组织中钓取了编码凝血因子X活性部位（FXa）的基因片段，并将其与HSP65基因相融合，构建了pET28-HSP65-FXa表达载体，在大肠杆菌中表达出HSP65-FXa融合蛋白。表达融合蛋白的主要目的是为了使目的蛋白呈可溶性表达，从而可以保证FXa的酶活性，然而，HSP65-FXa融合蛋白在BL21(DE3)中主要以包含体形式表达，这为后续的纯化工作增加了很多麻烦，蛋白质变复性不当就会造成蛋白质活性的丧失，因此，此项工作没有继续进行。综上所述，我们构建了两种抗O型口蹄疫病毒的重组蛋白，其中多表位重组蛋白具有一定的抗O型口蹄疫病毒感染的活性。构建和表达了重组凝血因子X，由于蛋白质主要以包含体形式表达，工作没有继续进行。 <WP=57>