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聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction),简称PCR,是一种体外快速扩增特定DNA片段的技术,是分子生物学最基础的技术之一,被广泛应用于生物学基础研究,临床诊断等领域。PCR技术简便、快速、特异性强等优点使其得到了广泛的应用,但是PCR技术亦尚存在一些不足之处需要改进,如当PCR反应体系中模板浓度过低或模板含有杂蛋白时PCR结果出现假阴性现象,而引物设计不合理时则容易出现假阳性的结果。究其主要原因是目前PCR技术扩增灵敏度及特异性有限。为了更好的发挥PCR技术的作用,研究人员不断对PCR技术进行优化与改进,主要方法有优化PCR反应条件及改变反应策略。此外向PCR反应体系中添加PCR添加剂也可有效提高PCR扩增效率或特异性。PCR添加剂是一种额外添加到PCR反应体系中以提高PCR扩增效率或防止无效扩增的物质。迄今为止,研究人员已经发现了各种各样的PCR添加剂如一些高分子聚合物、小分子化合物、纳米材料及蛋白质等,它们都以各自的特性在不同的方面对PCR反应起着促进作用。其中蛋白类添加剂因在活细胞中参与DNA复制、修复、重组等重要活动而引起人们对其在PCR这一体外DNA复制技术中应用的可行性考虑而被开发。然而生物体内类似的蛋白有很多,只要其有耐高温等特性都可被考虑研究。本课题选取了一种叫做整合宿主因子(Integration Host Factor)的耐高温的DNA结合蛋白作为研究对象。整合宿主因子是原核生物体内一种参与DNA复制、转录、整合等过程的DNA结合蛋白,它由两个具有30%同源性的异源亚基α亚基和β亚基组成。已有研究报道其β亚基能够在体外与DNA形成稳定性复合物。因此,综合整合宿主因子β亚基的这些特性,我们预测其对体外DNA复制技术PCR具有一定的作用。本课题将整合宿主因子β亚基体外重组表达纯化后,将其运用到PCR反应体系中,研究分析了其对PCR扩增效率及基于PCR的基因合成效率的影响。本研究获得的主要研究成果如下:1.IHF-β基因的获取利用基于PCR的基因合成技术自行设计了合成IHF-β基因所需的12条引物,用一步PCR法组装合成了IHF-β基因。经测序和比对证实所合成的IHF-β基因序列与目的基因100%同源。2.IHF-β蛋白的体外重组表达及优化构建了IHF-β蛋白的原核表达载体pET-22b-IHF-β,并将其转化到大肠杆菌表达宿主菌BL21中,将其用IPTG诱导表达并对诱导温度进行了优化,发现18℃过夜诱导表达可以得到较大量的可溶性IHF-β蛋白。3.IHF-β蛋白的纯化本研究分别采用了三种不同的纯化方法对可溶性表达及包涵体形式表达的IHF-β蛋白进行了纯化。结果显示,对可溶性性IHF-β蛋白用聚乙烯亚胺沉淀法与硫酸铵沉淀法相结合纯化的方法较为简便、快速,但重复性差;对包涵体形式表达的IHF-β蛋白用尿素溶解变性后透析复性纯化的方法可得到大量的有活性的IHF-β蛋白,但是纯化过程较为繁琐耗时较长;而用QIAGEN公司的Ni-NTA试剂盒纯化可溶性IHF-β蛋白则未能得到有活性的蛋白。4.IHF-β蛋白的应用初探本课题的初步研究结果显示,这种IHF-β蛋白在一定浓度范围内可以有效提高PCR扩增效率及基于PCR的基因合成效率。