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目的:利用TCGA、Rambrant、CGGA三大数据库的信息学分析发现EGFR和AJAP1负性相关,尤其在四亚型分型(Classical,Mesenchymal,Neural,and Proneural)中存在EGFR扩增和突变的Classical亚型。结合EGFRv Ⅲ(EGFR突变持续激活)慢病毒系统和小分子阻断剂,我们验证并证实恶性胶质瘤通过EGFR通路抑制抑癌基因AJAP1表达,从而增强其边缘侵袭能力,并且在体内和体外试验中验证MK2206可以有效阻断EGFRvⅢ下游通路活性,为EGFR扩增和EGFRvⅢ阳性恶性胶质瘤化疗提供新的方案。方法:1.生物信息学分析EGFR和AJAP1在不同临床样本数据库(TCGA、CGGA和Ranmbrant)中基因拷贝数、mRNA、蛋白水平的高低;利用含EGFRv Ⅲ表达载体的慢病毒转染U87和LN229,模拟胶质瘤细胞系中EGFR通路持续激活状态,在体外试验中验证EGFR通路激活对抑癌基因AJAP1转录表达的调控。2.用表达EGFRvⅢ突变体的慢病毒感染胶质瘤细胞系U87和LN229,Real-time PCR验证AJAP1 mRNA表达水平;蛋白免疫印迹方法检测EGFR、EGFRvⅢ、p-EGFR、AKT、p-AKT、AJAP1的表达水平变化;免疫荧光染色检测EGFR通路持续激活对胶质瘤细胞骨架和细胞形态的改变;Transwell实验检测EGFR通路持续激活对胶质瘤细胞迁移能力的影响。3.针对性选择课题预测的功能信号通路EGFR/EGFRvⅢ-PI3K-AKT-EZH2上不同节点的小分子抑制剂:LY294002(PI3K抑制剂)、MK2206(P-AKT抑制剂)、DZNEP(组蛋白三甲基化抑制剂),节段阻滞通路活性并观察AJAP1 mRNA和蛋白表达变化,观察通路阻滞后细胞骨架和形态改变是否恢复。4.通过生物信息学分析预测H3K27Me3在AJAP1启动子区域结合位点,针对性设计Chip-PCR找出对照组、EGFR通路持续激活组和通路激活后治疗组(挑选P-AKT小分子抑制剂)三组处理后H3K27Me3在AJAP1启动子区结合量的变化。5.构建胶质瘤EGFR/EGFRvⅢ颅内动物模型,研究P-AKT小分子抑制剂MK2206在颅内对EGFR/EGFRvⅢ下游AKT磷酸化的影响,体内实验验证阻断EGFR/EGFRvⅢ-PI3K-AKT-EZH2后AJAP1表达量变化和肿瘤边缘侵袭情况。结果:1.信息学分析显示EGFR和AJAP1在基因拷贝数上没有明显相关,但是在mRNA水平存在明显负相关;在TCGA、CGGA和Ranmbrandt三个数据库中EGFR富集的classcial亚型中,AJAP1和EGFR存在明显负相关,提示EGFR和AJAP1存在转录前调控关系。2.转染EGFRvⅢ病毒的胶质瘤细胞中EGFRv Ⅲ、p-EGFR和p-AKT表达明显上调,并且AJAP1表达水平明显下降;共聚焦显微镜成像显示过表达EGFRvⅢ后胶质瘤细胞AJAP1表达降低,且F-actin染色显示丝状伪足增多和板状伪足减少;Transwell实验显示EGFRvⅢ过表达后细胞迁移能力明显增强。3.胶质瘤细胞系过表达AJAP1后出现丝状伪足减少和板状伪足增多。4.在过表达EGFRvⅢ的胶质瘤细胞系中,梯度浓度使用PI3K抑制剂(LY294002)、p-AKT抑制剂(MK2206)和组蛋白三甲基化抑制剂(DZNEP)后AJAP1蛋白表达量上升;共聚焦显微镜成像显示过表达EGFRv Ⅲ组经过p-AKT抑制剂处理后AJAP1表达上调,且出现丝状伪足减少和板状伪足增多。5.免疫荧光染色显示EGFRvⅢ过表达后细胞核中H3K27Me3上调,P-AKT抑制剂MK2206处理后H3K27Me3表达下调;在核蛋白免疫印迹试验中出现同样的结果。6.Chi-PCR实验显示过表达EGFRv Ⅲ后H3K27Me3在AJAP1启动子区结合量增加,p-AKT抑制剂MK2206处理后结合量下降。7.87-Vector/87-EGFRv Ⅲ混合胶质瘤颅内模型证实P-AKT抑制剂能成功阻断EGFR/EGFRv Ⅲ下游AKT的磷酸化并上调AJAP1表达量,HE染色显示治疗组正常组织和肿瘤边界相对于对照组更加清晰。结论:1.EGFR/EGFRvⅢ信号通路激活可以改变胶质瘤细胞骨架结构,增加胶质瘤迁移能力。2.p-AKT、EZH2在过表达EGFRvⅢ胶质瘤细胞系中参与下调AJAP1。3.体内外研究显示阻断EGFR/EGFRvⅢ-AKT-EZH2可以上调AJAP1表达。4.EGFR/EGFRv Ⅲ通过p-AKT/EZH2信号传导通路上调AJAP1启动子区H3K27Me3结合量,从而下调AJAP1表达。5.p-AKT小分子抑制剂MK2206对EGFR/EGFRv Ⅲ信号通路异常激活的胶质瘤存在治疗效果。