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红曲霉菌是一种可食用真菌,是我国重要的微生物资源,其代谢生成的红曲色素作为一种天然可食用色素,在食品及医药领域有着广泛的应用。然而,红曲霉菌在发酵代谢过程中除了能够合成优质的天然食用色素红曲色素外,还会伴随着合成一种具有肾毒性的真菌毒素——桔霉素。本研究通过研究抗氧化物质如抗坏血酸对红曲霉菌低产桔霉素的作用影响,同时探索了一种红色红曲霉Monascus rubber CCTCC NO.M2013082 MnSOD原核表达的方法,并探讨了红曲霉源MnSOD对食品安全型红曲霉的作用。1、添加抗坏血酸至红曲霉发酵培养基中,对红曲霉菌代谢产物进行检测。在对红曲霉发酵物的脂肪酸组成进行检测分析后,结果发现红曲霉菌体胞外发酵液中的脂肪酸种类为5种,比胞内脂肪酸多一种,为短链脂肪酸丁二酸。而在外源性抗坏血酸(exogenous ascorbic acid,EAA)发酵液组中短链脂肪酸丁二酸的含量为26.731%,要高于对照组的19.444%。表明短链脂肪酸提升能够促进红曲色素的产率。同时对EAA组和对照组的抗氧化酶活进行检测分析,发现主要是红曲霉菌中抗氧化酶SOD活性差别较大,且结合桔霉素的结果,发现红曲霉中SOD活性和桔霉素的代谢有着密切的联系。2.基于基因工程技术进行红曲霉菌MnSOD基因的克隆和原核表达。通过设计出红曲菌H4000 MnSOD简并引物得到目的基因片段,再设计全长引物利用PCR技术扩增红曲霉MnSOD基因的全长序列。经Eco RⅠ和HindⅢ酶切后连接至相同酶切的表达载体p ET28a,并转化至E.coli BL21进行诱导表达。克隆得到的基因预测编码152个氨基酸,预测相对分子量约为17 k D。同时将克隆得到的MnSOD基因与NCBI数据库进行比对,发现该序列与橙色红曲霉超氧化物歧化酶(SOD)基因相似度达到99%,与炭疽菌、米曲霉、黄曲霉的MnSOD基因也有较高的相似度。通过SDS-PAGE检测蛋白表达情况,目标蛋白相对分子质量约为19 k D,与预测相对分子量基本相符。对该表达蛋白的耐酸性进行了检测,发现在p H 2.0保温处理1 h,酶活为159 U/mg,表明该蛋白具有较好的耐酸性。3.红曲霉是嗜酸性真菌,其生长环境p H偏酸性。鉴于表达得到MnSOD具有耐酸性,且MnSOD与红曲霉菌合成桔霉素有密切关系,本研究向红曲霉发酵培养基中添红曲菌源MnSOD在大肠杆菌中的表达产物及二乙基二硫代氨基甲酸钠(DDC,SOD的抑制剂),探讨其对红曲霉菌代谢的相关作用。研究结果发现,MnSOD的加入能够降低红曲霉代谢过程中产生的桔霉素,而抑制SOD活性的DDC添加则会使红曲霉菌的桔霉素产量上升,上升了约52%。通过检测红曲霉菌自由基清除活性,结果发现,加入SOD组分后的红曲霉发酵液的超氧阴离子清除能力最高,达到82%,而抑制SOD的DDC组分添加以后超氧阴离子清除能力低至56%。表明添加红曲霉MnSOD,能够提升了红曲霉抗氧化能力,从而影响红曲霉菌次级代谢产物桔霉素的生成。此外,对不同添加物组别的红曲霉菌胞内色素和胞内色素进行分析,DDC组的胞外色素含量最多,比对照组上升了35%。表明DDC能够影响细胞跨膜转运色素的能力,从而消除了细胞内色素的代谢抑制,增加了细胞内和细胞外色素的积累。这些结果说明,红曲菌MnSOD能够影响红曲霉次级代谢产物桔霉素形成,是很好的调控因子,为食品安全型红曲色素生物合成提供了新的思路。