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研究目的:骨质疏松的发生与骨生成减少和骨血管生成能力的衰退密切相关。在骨微环境中,骨生成与骨微环境血管生成相互耦联,成骨细胞能够分泌相关的血管生成因子来促进骨血管生成,骨血管为骨生成提供必要营养物质的同时也为骨生成传递信号刺激。运动能够有效防治骨质疏松,目前认为运动诱导的机械应力刺激及其对骨生成和骨微环境血管生成的促进作用是运动防治骨质疏松的可能机制之一。近年来有研究报道,Lnc RNA HOXA11-AS能够参与血管生成及骨形成的调控,但运动是否能够通过调控Lnc RNA HOXA11-AS的表达来促进骨生成和骨微环境血管生成并没有相关报道。因此本研究探究了运动及机械应力刺激对Lnc RNA HOXA11-AS表达的调控及其对相关成骨因子及血管生成因子表达的影响,为进一步探究运动促进骨生成和骨微环境血管生成的机制研究提供理论基础。研究方法:1动物实验选8周龄雌性C57BL/6小鼠18只,随机分为去卵巢组(Ovx),去卵巢+运动组(Ovx+Exe)每组9只。小鼠经麻醉后进行卵巢去除手术,在手术完成的4周后,去卵巢+运动组小鼠进行为期9周的跑台训练,每周五天,每天一小时。第一周预适应跑台训练:周一至周五,每天训练30min,速度6m/min;后八周为正式跑台训练阶段,起始速度为8m/min,后以周为单位每周增速1m/min,每天训练一小时包括5min的速度为6m/min的热身运动和55min的正式跑台训练;去卵巢组常规饲养,不进行任何干预。运动干预结束后每组随机选取3只小鼠的双腿股骨胫骨,进行总RNA提取后用于Lnc RNA基因芯片检测;取6只小鼠取左腿胫骨骨髓提取RNA用于相关基因表达的检测,筛选出表达差异较高的Lnc RNA采用Multiple Array Viewer作图。所有动物实验程序均符合ARRIVE准则和体育科学研究中的道德标准,并得到上海体育学院伦理委员会的批准。2细胞实验部分2.1成骨细胞21天分化实验将传代至第三代的原代成骨细胞以1×105/ml接种到六孔细胞培养板,分为Day0组、Day3组、Day7组、Day21组,共4组。种板12小时细胞完全贴壁后,开始分别对该四组成骨细胞进行为期0天、3天、7天、21天的成骨诱导分化培养。Day21组完成21天成骨诱导分化培养后,提取各组细胞RNA,采用Real-time PCR检测HOXA11-AS,OCN,Osterix及EGFL-6 m RNA的表达情况。2.2成骨细胞7天牵张实验将C57BL/6小鼠原代成骨细胞传代至第3代后以相同的密度接种到Bio Flex 6孔细胞培养板,等细胞长至70%后,以3%牵张幅度,0.5 Hz干预频率,4h干预时长,为期7天隔天进行一次,即第1,3,5,7天干预的牵张方案,使用Flexcell-5000细胞牵张仪对细胞进行机械牵张。对照组不进行牵张,只需静置培养7天。在牵张实验进行过程中,每48小时更换细胞完全培养液。同时收集细胞牵张后培养液,用于ALP染色、茜素红染色实验的成骨细胞培养。在机械牵张干预结束后收集细胞,提取对应孔细胞RNA和蛋白质。Real-time PCR检测HOXA11-AS,VEGF,EGFL-6,FGFR1及Osterix m RNA的表达情况;Western blot检测β-catenin,Osterix蛋白的表达。数据统计分析:所有结果用单因素方差分析及独立样本T检验表示,使用SPSS 20.0软件进行分析处理,组间采用Bonferrori法进行比较。统计图采用Graphpad软件(Prism5.0)制作。研究结果:1动物实验1.1 Ovx和Ovx+Exe两组小鼠的基因基因芯片检测显示:去卵巢小鼠在经过一定强度的跑台训练后,下肢骨中Gm31712,LOC102641308,Gm31126,HOXA11-AS4条Lnc RNA的基因表达明显上调;Vmnlr190-ps,Gm31202,LOC105247265,Gm26535 Lnc RNA的基因表达明显下调。1.2小鼠骨髓RNA经PCR检测显示:Ovx+Exe组与Ovx组相比小鼠骨髓中Lnc RNA HOXA11-AS的表达显著上调(P<0.05),提示一定强度的跑台训练能够促进小鼠骨骼中Lnc RNA HOXA11-AS基因的表达。2.细胞实验2.1成骨细胞21天分化过程中Lnc RNA HOXA11-AS及相关成骨因子和成血管因子的表达变化Real-time PCR结果显示:在成骨细胞的成骨分化过程中,OCN及Osterix等成骨因子m RNA表达逐步上调,Lnc RNA HOXA11-AS m RNA表达逐步上调。在成骨分化第7天时,OCN表达显著上调(P<0.01),第21天时其表达上调幅度更为明显(P<0.001);在成骨分化第7天时,Osterix表达亦显著上调(P<0.05),在第21天时其表达上调幅度更为明显(P<0.01);成骨分化第7天Lnc RNA HOXA11-AS表达显著上调(P<0.05),第21天时其表达上调幅度更为明显(P<0.01)。血管生成因子EGFL-6在成骨分化早期变化并不明显,成骨分化的后期表达开始上调,在成骨分化第21天时其表达明显上调(P<0.001)。2.机械牵张原代成骨细胞对Lnc RNAHOXA11-AS基因表达及相关成骨因子和成血管因子的影响(1)ALP染色结果显示:适宜的机械牵张使成骨细胞ALP的分泌显著上调(P<0.01)。(2)茜素红染色显示:适宜的机械牵张后,与空白对照组相比牵张组成骨细胞钙化结节显著增多(P<0.01)。(3)Western blot结果显示:适宜的机械牵张能够促进β-catenin,Osterix蛋白的表达,β-catenin蛋白表达显著上调(P<0.01),Osterix蛋白表达显著上调(P<0.05)。(4)Real-time PCR结果显示:在成骨细胞分化过程中,机械牵张力能够提高Osterix成骨因子的m RNA表达,其中第5、7天的机械牵张刺激效果最为明显,有显著性差异(P<0.05)。在机械牵张力的刺激下,EGFL-6、VEGF和FGFR1等血管生成因子m RNA表达有逐步上调的趋势,在机械牵张的第7天,EGFL-6、VEGF的m RNA表达均显著上调(P<0.001)。但FGFR1 m RNA的表达在机械牵张7天时显著上调(P<0.05)。Lnc RNA HOXA11-AS m RNA在经5天机械牵张后表达无明显变化,第7天机械牵张后表达显著上调(P<0.001)。研究结论:运动能够诱导去卵巢骨质疏松小鼠骨骼中Lnc RNA s发生差异性表达,上调骨髓中Lnc RNA HOXA11-AS的表达;成骨分化过程中Lnc RNA HOXA11-AS表达显著上调,相关成骨因子OCN、Osterix表达显著上调;适宜的机械牵张应力刺激能够促进成骨细胞的成骨分化,同时上调Lnc RNA HOXA11-AS、相关成骨因子以及相关成血管因子的表达。