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塞隆骨是卫生部于1990年批准的建国以来第一个国家级一类动物新药材,前期药理药效研究表明塞隆骨具有镇痛、抗骨质疏松和抗类风湿关节炎等功效。为了揭示塞隆骨抗风湿功效的化学本质,实现对塞隆骨的深层次开发,本研究从以下三个方面进行了探讨。 1、塞隆骨分离方法的研究 利用硅胶色谱柱(10μm,100(A),DAISO)和二醇基色谱柱(10μm,100(A),YMC)建立了一种针对塞隆骨弱极性化合物的分析/制备方法。利用普通C18色谱柱(10μm,120(A), DAISO)和亲水性C18色谱柱(10μm,100(A),YMC)建立了一种针对塞隆骨中等极性化合物的制备方法,所建立的方法具有较好的正交性和分离效率。使用这两种分离方法,共制备了4个甾体类物质、5个脂肪酸类物质和5个二酮哌嗪类物质。所有制备的化合物纯度均在97%以上。 2、塞隆骨化合物的活性研究 实验选用Jurkat T细胞和Raw264.7细胞对所分离的弱极性化合物进行活性筛选。化合物Fr.6-1、Fr.6-2和Fr.9-1对Jurkat T细胞和Raw264.7细胞的抑制效果较好,化合物Fr.6-1对Jurkat T和Raw264.7细胞的半数抑制量(IC50)分别为32.1μg/mL和35.7μg/mL,化合物Fr.6-2对Jurkat T和Raw264.7细胞的IC50分别为37.9μg/mL和38.3μg/mL,化合物Fr.9-1对Jurkat T和Raw264.7细胞的IC50分别为28.7μg/mL和30.6μg/mL。采用二氢乳清酸脱氢酶模型对塞隆骨二酮哌嗪类物质进行活性筛选,发现化合物Fr.P1-4具有较好的酶抑制活性,IC50为0.773μM,利用分子模拟的方法研究活性化合物抑制二氢乳清酸脱氢酶的机理发现,Fr.P1-4的羟基对其活性非常关键,可以通过H201水分子与Arg136形成氢键增强结合能。范德华能是该药物分子结合时的主要能量,氢键可以通过校正小分子在活性空腔内的位置增强范德华能,因此在进行结构改造时,应着重加强其尾部苯环区的疏水作用力。 3、塞隆骨活性蛋白质组学的研究 使用亲和层析寻找7OH3ONE的靶点蛋白质,发现40个特异性结合蛋白质。利用DAVID数据库和STRING数据库对所鉴定的蛋白质进行功能定位,发现这些相互作用蛋白主要分布于氨酰tRNA合成酶途径和白细胞迁移信号通路,可能从影响氨酰tRNA合成酶的生理功能、调节白细胞迁移时形态的变化和细胞因子的表达三个方面对免疫细胞功能进行调控。 塞隆骨定量蛋白质组学共解析了474个虎骨蛋白质和607个塞隆骨蛋白质的种类和含量信息。塞隆骨有472个蛋白质与虎骨中的完全相同,在共有蛋白质中,483个蛋白质的含量塞隆骨中明显高于虎骨,34个蛋白质含量低于虎骨。