小白链霉菌的ARTP诱变及超声辅助发酵生产ε-聚赖氨酸的研究

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ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是由L-赖氨酸(L-Lys)单体通过α-COOH和ε-NH2脱水缩合而成的天然聚氨基酸,具有良好的水溶性、抗菌性,安全环保,可用作食品防腐剂。然而天然菌株产生ε-PL的能力低,因此可以通过选育高产菌株和提高发酵效率以促进ε-PL的生产。本研究采用常压室温等离子体(Atmospheric and Room Temperature Plasma,ARTP)诱变小白链霉菌Streptomyces albulus(CICC 11022),筛选出高产ε-PL突变株,利用基因组学和代谢组学的方法初步研究其高产机制;对可进行稳定传代的突变菌株建立超声辅助小白链霉菌S.albulus发酵技术,通过比较分析超声辅助发酵引起的动力学、细胞活力、呼吸速率、能量变化和关键酶活力及转录水平的变化,探究超声处理对小白链霉菌S.albulus发酵的影响机制。主要研究结果如下:(1)以小白链霉菌S.albulus(CICC 11022)为出发菌株,利用ARTP诱变方法选育出高产ε-PL菌株。结果表明,在功率为120 W、通气量为10 SLM(标况下升每分钟,Standard Litre per Minute)、诱变时间120 s的条件下,ARTP对菌株致死率为88.78%。通过结合抗性平板和抑菌圈筛选的方法,从300株突变菌株中筛选出一株ε-PL产量提高且传代稳定的突变菌株SAR 14-116,与出发菌株相比产量提高了18.46%,达到1.04 mg/mL。通过扫描电镜观察发现,与出发菌株相比,种子液中突变菌株SAR 14-116带有“毛刺状”突起的孢子占比更大,发酵液中突变菌株SAR 14-116气生菌丝含有更多分支。经ARTP处理的小白链霉菌胞内钙离子浓度增加,说明ARTP处理改变了小白链霉菌细胞膜的通透性。(2)通过基因组重测序分析,对出发菌株SAB和突变菌株SAR 14-116进行对比,从分子水平解析ARTP诱变提高诱变菌株产量的作用机制。研究结果表明,与出发菌株相比,突变株SAR 14-116共有88个单核苷酸多态性(SNP)和57个插入缺失(In Dels),所有这些突变位点总共涉及65个基因。这些改变的基因在氨基酸、脂质、碳水化合物转运和代谢、细胞生长和次级代谢及细胞膜成分等方面发挥重要作用,表明ARTP可能通过细胞中多种功能的改变提高了ε-PL产量。(3)通过非靶向代谢组学分析方法,对出发菌株SAB和突变菌株SAR 14-116进行了对比分析,从代谢水平解析其产量提高的作用机制。研究结果表明,基于KEGG数据库的代谢途径富集涉及64个复杂的代谢过程和851种不同的代谢产物。突变菌株SAR 14-116中ε-PL产量的增加可能与L-赖氨酸合成和降解过程中代谢产物上调有关。代谢通路富集结果显示,与出发菌株相比,氨基酸代谢中赖氨酸、精氨酸及组氨酸含量都增加。小白链霉菌S.albulus发酵过程中赤藓糖-4-磷酸和5-甲基四氢叶酸含量显著上调(p<0.05),说明ε-PL合成过程中的碳代谢相对活跃;而L-谷氨酸和L-谷氨酰胺的含量显著下降(p<0.05),可能通过对谷氨酸通路的抑制影响了ε-PL合成过程中的氮代谢;S-D-乳糖基谷胱甘肽和乙酰基柠檬酸三丁酯的含量显著下降(p<0.05),可能通过影响糖酵解旁路和TCA循环从而引起能量代谢的变化;另外,根据脂类代谢结果发现,适当强度的ARTP处理会造成S.albulus菌体中与膜系统相关的物质发生变化。(4)建立了超声波辅助小白链霉菌发酵产ε-PL工艺,并初步研究了超声作用的机制。得到最佳超声处理条件为:对培养至对数中期(30 h)的小白链霉菌以频率为28 kHz、功率密度为280 W/L的超声处理1 h,超声处理使得菌体干重和ε-PL浓度分别提高了14.92%和28.45%。发酵动力学研究结果表明,超声处理组的产物合成参数β是对照组的2.88倍。酶活测定试验结果显示超声波处理使得SAR 14-116中己糖激酶(Hexokinase,HK)活力提高了461%,表明超声波通过提高HK酶活力,可能增加了糖酵解途径的代谢强度。丙酮酸激酶(Pyruvate Kinase,PK)和天冬氨酸转氨酶(Aspartate Aminotransferase,AAT)在超声刺激后3 h和6 h时分别提高了249%和81.15%,可能促进了ε-PL的前体物质L-赖氨酸(L-Lys)的合成;超声处理使得磷酸戊糖(Pentose Phosphate Pathway,PPP)途径中关键酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose 6-Phosphatedehydrogenase,G6PDH)酶活力降低,可能改变了PPP途径的碳通量分布。此外,超声处理还使菌体胞内ATP含量提高了90.63%。关键酶基因转录水平测定结果显示基因pk、cs及aat表达分别上调1.69、1.54和1.34倍,表明超声处理可能增加了细胞糖酵解途径、TCA循环和DAP途径的代谢强度;同时编码ε-PL合成酶的基因pls表达水平上调了4.58倍,可能直接提高了SAR 14-116菌株合成ε-PL的能力。
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