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目的:创伤性颅脑损伤(Traumatic Brain Injury,TBI)后脑血管痉挛(cerebral vasospasm,CVS)是TBI后的严重并发症之一,是引起TBI后脑缺血、脑梗死等继发性脑损伤和致死致残的重要原因,但目前仍尚不清楚其具体发病机制。本课题组前期研究证实小鼠TBI后可释放脑源性微粒通过破坏的血脑屏障释放入外周循环血中,且鼠尾静脉注射一定数量脑源性微粒可导致小鼠死亡,但病理尸检未发现死亡小鼠存在器质性致死原因,故推测其致死原因为血管痉挛等功能性改变。本研究将在前期研究基础上,继续研究脑源性微粒在小鼠TBI后脑血管痉挛中的作用,检测其对平滑肌细胞、内皮细胞等血管构成细胞胞内钙离子浓度的作用及脑血流量的影响,同时检测钙离子拮抗剂尼莫地平对脑源性微粒介导的脑血管痉挛的治疗作用。本研究将阐明TBI后脑血管痉挛的早期发生机制,丰富TBI后脑血管痉挛的病生理机制理论,为TBI后脑血管痉挛的诊疗提供新思路和理论依据。方法:(1)体外制备脑源性微粒并进行电镜及粒径鉴定,鼠尾静脉注射后测定其半数致死剂量,为后续体内外深入研究脑源性微粒的病生理机制提供可靠有效的基础数据。(2)体外血管环张力实验检测脑源性微粒的致血管痉挛作用及尼莫地平的解痉作用,体内激光散斑血流动态成像实验检测脑源性微粒对脑血流灌注量的作用。(3)体外细胞实验通过共聚焦荧光显微镜技术和流式细胞术测定脑源性微粒对脑动脉平滑肌细胞和脐静脉内皮细胞内游离钙离子的影响。(4)体外细胞实验通过膜片钳技术检测脑源性微粒对电压门控性钙离子通道的调控作用,以期探索脑源性微粒的致血管痉挛机制。(5)体外细胞实验采用离子电导显微镜技术观察脑源性微粒对脑动脉平滑肌细胞和脐静脉内皮细胞等血管构成细胞形态的影响。(6)体外细胞实验采用共聚焦显微镜技术观察脑源性微粒对脑动脉平滑肌细胞和脐静脉内皮细胞等血管构成细胞骨架的影响。(7)蛋白质免疫印迹手段测定脑源性微粒对平滑肌收缩的最终阶段肌球轻链蛋白的影响;(8)通过质谱分析方法测定脑源性微粒的磷脂构成,探讨体外制备的磷脂微粒和去除磷脂的脑源性微粒的上述作用,以明确脑源性微粒的致痉挛作用与其结构完整性的关系。结果:(1)体外制备的脑源性微粒透射电镜下可见有完整的膜结构,Nano sight检测其直径位于100-1000nm之间,鼠尾静脉注射后可出现不同的临床表现,鼠尾静脉注射量与死亡率呈正相关。(2)脑源性微粒可在体外动脉环张力实验中引起颈总动脉血管环收缩,体内实验证实脑源性微粒可造成脑血流灌注量下降,尼莫地平可部分阻断上述作用。(3)体外细胞实验证实脑源性微粒可引起血管构成细胞内游离钙离子浓度升高,而尼莫地平可部分阻断此作用。(4)离子电导显微镜证实脑源性微粒可导致平滑肌细胞和内皮细胞高度升高,证实脑源性微粒可导致骨架蛋白的变化而引起平滑肌细胞和内皮细胞收缩。(5)脑源性微粒可促进电压门控性钙离子通道的开放,尼莫地平可部分阻断此作用。(6)根据脑源性微粒质谱分析结果鼠尾静脉注射体外制备磷脂微粒和SDS处理后的脑源性微粒,未发现致血管痉挛作用。结论:(1)TBI后释放入循环血中的脑源性微粒作用于平滑肌细胞及内皮细胞导致血管痉挛,进而导致脑血流量下降,严重者可致死。(2)脑源性微粒可引起平滑肌细胞及内皮细胞胞内游离钙离子浓度的升高继而导致细胞形态和细胞骨架发生改变,其主要机制为脑源性微粒促进电压门控性钙离子通道的开放。(3)脑源性微粒的致血管痉挛作用有赖于其结构的完整性,尼莫地平可部分阻断其致痉挛作用。本研究揭示了一种新的颅脑创伤后发生脑血管痉挛的病生理机制,并初步探索了相应的治疗方法。