牦牛皱胃全长转录组测序与胃溶菌酶突变表达及抑菌研究

来源 :西南民族大学 |
牦牛(Bos grunniens)是高寒地区特有牛种,长期以来为高原地区的牧民提供了食、住、行等有效生活保障和经济来源。牦牛皱胃作为新生牦牛唯一具有消化功能的真胃,不仅能分泌胃酸以消化食物中的蛋白质和脂肪,还能分泌具有抗
牦牛(Bos grunniens)是高寒地区特有牛种,长期以来为高原地区的牧民提供了食、住、行等有效生活保障和经济来源。牦牛皱胃作为新生牦牛唯一具有消化功能的真胃,不仅能分泌胃酸以消化食物中的蛋白质和脂肪,还能分泌具有抗酸、抗胃蛋白酶能力的溶菌酶。溶菌酶(lysozyme,LYZ)是动物机体中关键的先天免疫因子,具有杀菌、抗病毒、抗炎和免疫调节作用。本研究利用PacBio SMRT测序技术对牦牛皱胃全长转录组进行测序,获得了牦牛皱胃全长转录组数据。并对牦牛胃溶菌酶(yak stomach lysozyme 1a,ysLYZ1a)和氨基酸突变牦牛胃溶菌酶(mutant yak stomach lysozyme 1a,mysLYZ1a)进行真核表达与纯化。利用体外试验探究ysLYZ1a、mysLYZ1a对金黄色葡萄球菌、E.coli O111和肠沙门氏菌的抑制作用,利用体内试验探究ysLYZ1a、mysLYZ1a对小鼠E.coli O111腹泻的治疗效果。主要研究结果如下:1.利用PacBio Sequel平台测序获得了牦牛皱胃全长转录组数据,共获得14 467 420个子序列,过滤和去冗余后对比参考基因组最终获得8 556条非重复序列(Unigenes)。对转录组数据进行了NR、Swiss-Prot、KEGG、KOG、egg NOG、GO和Pfam七大数据库对比注释,分别注释到8 544、8 475、1 721、6 572、8 491、7 725、8 162条Unigenes。通过转录因子(transcription factor,TF)注释分析得到943个TFs,分布在51个TFs家族。CDS预测到8 544个基因片段可视为CDS编码区,共有82条注释到溶菌酶序列。SSR分析检索出3 596个SSR位点,可变剪切分析得到1 825个可变剪接事件。2.通过查阅文献资料,确定mysLYZ1a氨基酸突变位点:A18D、K43T、Q102S。利用人工合成的方法构建ysLYZ1a和mysLYZ1a基因的真核表达载体p PICZαA-ysLYZ1a、p PICZαA-mysLYZ1a,化学法转化至毕赤酵母X33菌株。诱导表达并纯化后ysLYZ1a比酶活为1 424.17 U/mg,mysLYZ1a比酶活为2 649.28U/mg。结果表明mysLYZ1a比酶活比ysLYZ1a比酶活提高了1 225.11 U/mg。3.通过体外抑菌试验,表明ysLYZ1a和mysLYZ1a对3种试验菌的抑菌效果由强到弱是:金黄色葡萄球菌>肠沙门氏菌>E.coli O111。在体内模型试验中,通过腹腔注射E.coli O111建立小鼠腹泻模型,使用抗生素、ysLYZ1a和mysLYZ1a分别对腹泻小鼠进行治疗,并与正常组、感染组比较。与正常组相比,感染组小鼠体重明显下降,白细胞数目显著增多,肺脏、脾脏指数显著增高(P<0.05),十二指肠损伤严重,而经抗生素、ysLYZ1a、mysLYZ1a治疗后各组指标较感染组均有所改善。通过对各组小鼠肠道菌群α多样性和β多样性分析,结果显示,E.coli O111感染会显著降低肠道菌群多样性和丰富度(P<0.05)。感染组肠道菌群变形菌门、厚壁菌门相对丰度显著增加,而拟杆菌门显著减少;mysLYZ1a、抗生素治疗后拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门的比例基本恢复正常,弯曲杆菌少量增多;而ysLYZ1a治疗后变形菌门仍有所增多。mysLYZ1a、抗生素可通过增加肠道有益菌丰度和降低有害菌丰度来恢复菌群结构,ysLYZ1a组还存在少量大肠杆菌,有害菌增加,少量有益菌增加,ysLYZ1a组治疗效果较mysLYZ1a组和抗生素组差。
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