论文部分内容阅读
摘要 [目的] 探讨辣木茎段的最佳消毒方法。[方法] 以辣木茎段为外植体，用不同消毒剂（升汞、次氯酸钠），选用不同浓度，在不同消毒时间下对辣木茎段进行消毒处理。[结果] 次氯酸钠最佳消毒组合为浓度15 g/L消毒20 min，污染率为26%，成活率为34%。升汞最佳消毒组合为0.20 g/L消毒液消毒5 min，污染率为2%，成活率达84%。 [结论] 辣木茎段最佳消毒方法为：在75%酒精中浸泡30 s后，用0.20 g/L升汞处理5 min，污染率为2%，成活率达84%。
关键词 辣木；外植体；消毒
中图分类号 S723.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）17-232-03
Abstract [Objective] The aim was to explore the best method of Moringa oleifera Lam. stem disinfection.[Method]With M. oleifera Lam. stem as explant， the effects of different concentration of mercuric chloride and sodium hypochlorite with different sterilization time were studied. [Result] The best combination for NaClO was 15 g/L with 20 min disinfection， contamination rate was 26%， and survival rate was 40%. The best combination for HgCl2 was 0.20 g/L with 5 min disinfection， contamination rate was 2%， survival rate could reach 84%.[Conclusion] The best method of M. oleifera Lam. stem disinfection was that 75% alcohol immersion 30 s， after treated with 0.2 g/L mercuric chloride 5 min， contamination rate was only 2%， the survival rate could reach 84%.
Key words Moringa oleifera Lam.； Explants； Disinfection
辣木树（Moringa oleifera Lam.，英文名：Moringa tree），又称鼓槌树、山葵树，属于辣木树科，为多年生常绿小乔木至大乔木，现已知共有14种，供食用栽培的有印度辣木树和非洲辣木树2个品种。辣木全株都可利用，含有丰富的营养成分与抗营养成分 [1-4]，矿物质和维生素含量也高于世界卫生组织（WHO）的推荐摄取标准[5-6]。大量研究证明了辣木的医疗保健功能[7-13]。此外还含有人体必需的各种氨基酸和微量元素等，其营养价值与被称为“人类营养微型宝库”的螺旋藻相当。辣木树作为蔬菜和食品有增进营养和食疗保健功能，可用来增强免疫力，对艾滋病（AIDS）有一定的辅助治疗作用，可以解决营养不良问题[5-6、14-16]，CWS（Church World Service）呼吁贫困地区将其作为主要营养食物。
随着辣木各种用途及产品被人们所认识，在进入21世纪后作为一种新食品资源更加引起人们的重视[17]。辣木喜温，耐干旱，生长快，非常适宜在云南省热区推广种植[18]。目前，种植辣木的地区越来越多，传统的种子育苗已不能满足市场需要。生产上种植的辣木有90%以上是采用种子育苗，存在性状不稳定、抗病差、产量低等问题，而以辣木茎段为外植体，通过组织培养生产辣木种苗，可保证品种的稳定性、抗病性及品质，对促进云南辣木良种选育及种苗繁殖推广具有重要意义。该研究通过比较多种消毒方法，旨在建立适于辣木外植体的消毒程序，为辣木快速繁殖奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料为新抽发的辣木嫩茎。
1.2 试验方法
1.2.1 外植体处理及清洗。
剪取新抽发的辣木嫩枝，去除叶片，留带腋芽的茎段，剪成4 cm左右长度，用自来水冲洗干净备用。
1.2.2 外植体消毒灭菌。
（1）将清洗干净的辣木茎段放入玻璃瓶中，在超净工作台中用75%酒精浸泡30 s左右。
（2）用镊子取出后放入事先配制好的消毒剂中（消毒剂浓度及消毒时间见表1），并不停地轻轻摇动，驱除气泡，以促进材料各部分与消毒液充分接触，消毒材料不宜放多，以保证消毒液充分浸泡辣木茎段，使消毒彻底；消毒时间为外植体加入消毒液开始计时，至取出外植体结束。
（3）在消毒结束前1 min，取出辣木茎段并将其放入无菌水中，摇动装有无菌水和辣木茎段的瓶子30 s。
（4）取出辣木茎段并将其放入干净的无菌水中，摇动瓶子30 s以上。如此重复5次，必须洗净消毒剂。
1.2.3 接种。
将上述冲洗好的辣木茎段，按无菌操作要求将外植体切成一个节间、长1 cm左右茎段，接种于不定芽诱导培养基（添加一定浓度生长激素的MS培养基）上，每瓶接1个茎节，每个处理接种50瓶。经消毒处理好的外植体，必须切除原伤口，否则原伤口处被消毒剂伤害的细胞会对外植体后期生长产生影响。
1.2.4 培养条件。
培养温度为28 ℃，光照强度2 000 lx，光照时间10 h/d。 1.3 统计方法
培养3 d，开始观察污染情况；培养10 d，统计污染情况；培养21 d后，统计成活率和死亡褐化率。
污染率=（污染的外植体数/接种的外植体数）×100%
成活率=（成活的外植体数/接种的外植体数）×100%
死亡褐化率=（死亡褐化的外植体数/接种的外植体数）×100%
2 结果与分析
2.1 升汞对辣木外植体消毒灭菌的影响
培养3 d，观察污染情况，HgCl2处理的茎段只有0.05 g/L浓度处理时有少量污染，5 d后0.10 g/L浓度处理的茎段也开始出现污染，在培养10 d统计污染情况时，发现灭菌时间为15 min的茎段已开始褐化甚至有死亡的现象。
从图1可以明显看出，无论消毒灭菌时间多久，污染率都随消毒时间增加而降低，而死亡褐化率都随HgCl2浓度增加而增加；当灭菌时间为5 min时，成活率随HgCl2浓度增加而升高，灭菌时间为10 min时，成活率先升高后降低，灭菌时间为15 min时，成活率呈下降趋势。这样的升降规律说明HgCl2消毒灭菌时间对于辣木茎段来说是至关重要的。
2.2 次氯酸钠对辣木外植体消毒灭菌的影响
NaClO处理的茎段在3 d观察污染时就已经大量污染了，但是培养10 d后仍然没有发现褐化死亡。
从表2可以看出，采用NaClO对辣木茎段进行消毒，消毒时间≤10 min的外植体污染率为100%；消毒时间≥15 min时，污染率随着消毒时间的增加而降低，死亡褐化率和成活率随浓度的增加而升高；消毒时间20 min、消毒液浓度为15 g/L时，效果最好，污染率为26%，成活率为34%，死亡褐化率为40%。
3 结论与讨论
通过该试验研究得出：以辣木茎段为外植体，先用75%酒精浸泡30 s后，再用0.20 g/L HgCl2消毒处理5 min效果最佳，污染率为2%，成活率高达84%，死亡褐化率为14%；其次是0.15 g/L HgCl2消毒处理5 min，污染率为10%，成活率高达78%，死亡褐化率为12%；NaClO处理效果最好的成活率仅40%。这就说明对于消毒灭菌而言，除了处理时间很关键以外，消毒剂的选择也至关重要。该试验选择75%酒精浸泡30 s，利用酒精渗透压吸收细菌的水分，杀死外植体表面细菌，再分别用HgCl2和NaClO处理，HgCl2中含有的重金属离子可使含有巯基、氨基、二巯基、羟基等的酶受到损伤甚至失去活性，丧失功能，这2种方法互补不足，因此消毒效果显著；而NaCLO则是利用其氧化作用消毒，仅能杀死外植体表面的少量细菌，效果跟75%酒精相似，将NaCLO与酒精组合，消毒效果欠佳。
参考文献
[1] 张涛，马海乐，钟慧慧.分光光度法测定辣木多糖含量[J].粮油食品科技，2003，12（1）：32-33.
[2] 赵燕南，王力舟.现代化妆品中的经典植物油——辣木籽油[J].中国化妆品：专业版，1997（3）：25.
[3] 王有琼，段琼芳，孙龙，等.辣木油浸提方法探讨[J].林业科技开发，2004（4）：12-13.
[4] RAJANGGAM J，AZAHAKIA MANAVALAN R S.辣木在南印度的生产及利用状况[J].印度科技，2000（4）：189.
[5] 刘昌芬.辣木的营养价值[J].热带农业科技，2004，27（1）：4-8.
[6] 陈惠民，周佳莹.植物中的钻石——高经济价值的辣木[M].台湾：商州出版社，2005：76.
[7] FOLKARD G，SUTHERLAND J.Moringa oleifera Lam：A tree and a litany of potential[J].Agroforestry Today，1996，8（3）：5-8.
[8] RAM J.Moringa：a highly nutritious vegetable tree，in Triades，technical bulletin NO.2[R].1994：12.
[9] CHING L S，MOHAMED S.Alpha.tocopherol content in 62 edible tropical plant[J].Agric Food Chem，2001（4）：101-105.
[10] CHURCH WORLD WORLD SERVICE，The Miracle tree：Moringa oleifera[EB/OL].http：//www.Moringa tree.Org/TMT nutrition.html.
[11] VLAHOV G，KIPRONO CHEPKWONY P，NDALUT P K.13C NMR characterization of triacylglycerols of Moringa oleifera seed oil：An “oleic vaccenic acid” oil[J].AGRIC Food Chem，2002，50（5）：970-975.
[12] LIMAYE D A，NIMBKAR A Y，JAM R，et al.Cardiovascular effects of the aqueous extract of Moringa pterygosperma[J].Phytother Research，1995，9（1）：37-40.
[13] RAMACHANDRAN C，PETER K V，GOPALAKRISHNAN P K.Drumstick（Moringa oleifera Lam）：A multipurpose Indian vegetable[J].Economic Botany，1980，34：276-283.
[14] 刘永红，李会珍.辣木的利用价值与栽培技术[J].福建热带科技，2003，9（2）：34-35.
[15] 刘昌芬.不同品种和产地辣木叶片营养成分含量[J].热带农业科技，2004（1）：1-2.
[16] 刘昌芬.辣木的研究现状及其开发前景[J].热带农业科技，2002，25（3）：20-24.
[17] 杨炎，刘昌芬，龙继明.不同栽培基质对辣木农艺性状的影响[J].热带农业科技，2014，37（2）：17-20.
[18] 罗云霞，陆斌，石卓功.辣木的特性与价值及其在云南引种发展的景况[J].西部林业科学，2005，35（4）：137-145.
关键词 辣木；外植体；消毒
中图分类号 S723.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）17-232-03
Abstract [Objective] The aim was to explore the best method of Moringa oleifera Lam. stem disinfection.[Method]With M. oleifera Lam. stem as explant， the effects of different concentration of mercuric chloride and sodium hypochlorite with different sterilization time were studied. [Result] The best combination for NaClO was 15 g/L with 20 min disinfection， contamination rate was 26%， and survival rate was 40%. The best combination for HgCl2 was 0.20 g/L with 5 min disinfection， contamination rate was 2%， survival rate could reach 84%.[Conclusion] The best method of M. oleifera Lam. stem disinfection was that 75% alcohol immersion 30 s， after treated with 0.2 g/L mercuric chloride 5 min， contamination rate was only 2%， the survival rate could reach 84%.
Key words Moringa oleifera Lam.； Explants； Disinfection
辣木树（Moringa oleifera Lam.，英文名：Moringa tree），又称鼓槌树、山葵树，属于辣木树科，为多年生常绿小乔木至大乔木，现已知共有14种，供食用栽培的有印度辣木树和非洲辣木树2个品种。辣木全株都可利用，含有丰富的营养成分与抗营养成分 [1-4]，矿物质和维生素含量也高于世界卫生组织（WHO）的推荐摄取标准[5-6]。大量研究证明了辣木的医疗保健功能[7-13]。此外还含有人体必需的各种氨基酸和微量元素等，其营养价值与被称为“人类营养微型宝库”的螺旋藻相当。辣木树作为蔬菜和食品有增进营养和食疗保健功能，可用来增强免疫力，对艾滋病（AIDS）有一定的辅助治疗作用，可以解决营养不良问题[5-6、14-16]，CWS（Church World Service）呼吁贫困地区将其作为主要营养食物。
随着辣木各种用途及产品被人们所认识，在进入21世纪后作为一种新食品资源更加引起人们的重视[17]。辣木喜温，耐干旱，生长快，非常适宜在云南省热区推广种植[18]。目前，种植辣木的地区越来越多，传统的种子育苗已不能满足市场需要。生产上种植的辣木有90%以上是采用种子育苗，存在性状不稳定、抗病差、产量低等问题，而以辣木茎段为外植体，通过组织培养生产辣木种苗，可保证品种的稳定性、抗病性及品质，对促进云南辣木良种选育及种苗繁殖推广具有重要意义。该研究通过比较多种消毒方法，旨在建立适于辣木外植体的消毒程序，为辣木快速繁殖奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料为新抽发的辣木嫩茎。
1.2 试验方法
1.2.1 外植体处理及清洗。
剪取新抽发的辣木嫩枝，去除叶片，留带腋芽的茎段，剪成4 cm左右长度，用自来水冲洗干净备用。
1.2.2 外植体消毒灭菌。
（1）将清洗干净的辣木茎段放入玻璃瓶中，在超净工作台中用75%酒精浸泡30 s左右。
（2）用镊子取出后放入事先配制好的消毒剂中（消毒剂浓度及消毒时间见表1），并不停地轻轻摇动，驱除气泡，以促进材料各部分与消毒液充分接触，消毒材料不宜放多，以保证消毒液充分浸泡辣木茎段，使消毒彻底；消毒时间为外植体加入消毒液开始计时，至取出外植体结束。
（3）在消毒结束前1 min，取出辣木茎段并将其放入无菌水中，摇动装有无菌水和辣木茎段的瓶子30 s。
（4）取出辣木茎段并将其放入干净的无菌水中，摇动瓶子30 s以上。如此重复5次，必须洗净消毒剂。
1.2.3 接种。
将上述冲洗好的辣木茎段，按无菌操作要求将外植体切成一个节间、长1 cm左右茎段，接种于不定芽诱导培养基（添加一定浓度生长激素的MS培养基）上，每瓶接1个茎节，每个处理接种50瓶。经消毒处理好的外植体，必须切除原伤口，否则原伤口处被消毒剂伤害的细胞会对外植体后期生长产生影响。
1.2.4 培养条件。
培养温度为28 ℃，光照强度2 000 lx，光照时间10 h/d。 1.3 统计方法
培养3 d，开始观察污染情况；培养10 d，统计污染情况；培养21 d后，统计成活率和死亡褐化率。
污染率=（污染的外植体数/接种的外植体数）×100%
成活率=（成活的外植体数/接种的外植体数）×100%
死亡褐化率=（死亡褐化的外植体数/接种的外植体数）×100%
2 结果与分析
2.1 升汞对辣木外植体消毒灭菌的影响
培养3 d，观察污染情况，HgCl2处理的茎段只有0.05 g/L浓度处理时有少量污染，5 d后0.10 g/L浓度处理的茎段也开始出现污染，在培养10 d统计污染情况时，发现灭菌时间为15 min的茎段已开始褐化甚至有死亡的现象。
从图1可以明显看出，无论消毒灭菌时间多久，污染率都随消毒时间增加而降低，而死亡褐化率都随HgCl2浓度增加而增加；当灭菌时间为5 min时，成活率随HgCl2浓度增加而升高，灭菌时间为10 min时，成活率先升高后降低，灭菌时间为15 min时，成活率呈下降趋势。这样的升降规律说明HgCl2消毒灭菌时间对于辣木茎段来说是至关重要的。
2.2 次氯酸钠对辣木外植体消毒灭菌的影响
NaClO处理的茎段在3 d观察污染时就已经大量污染了，但是培养10 d后仍然没有发现褐化死亡。
从表2可以看出，采用NaClO对辣木茎段进行消毒，消毒时间≤10 min的外植体污染率为100%；消毒时间≥15 min时，污染率随着消毒时间的增加而降低，死亡褐化率和成活率随浓度的增加而升高；消毒时间20 min、消毒液浓度为15 g/L时，效果最好，污染率为26%，成活率为34%，死亡褐化率为40%。
3 结论与讨论
通过该试验研究得出：以辣木茎段为外植体，先用75%酒精浸泡30 s后，再用0.20 g/L HgCl2消毒处理5 min效果最佳，污染率为2%，成活率高达84%，死亡褐化率为14%；其次是0.15 g/L HgCl2消毒处理5 min，污染率为10%，成活率高达78%，死亡褐化率为12%；NaClO处理效果最好的成活率仅40%。这就说明对于消毒灭菌而言，除了处理时间很关键以外，消毒剂的选择也至关重要。该试验选择75%酒精浸泡30 s，利用酒精渗透压吸收细菌的水分，杀死外植体表面细菌，再分别用HgCl2和NaClO处理，HgCl2中含有的重金属离子可使含有巯基、氨基、二巯基、羟基等的酶受到损伤甚至失去活性，丧失功能，这2种方法互补不足，因此消毒效果显著；而NaCLO则是利用其氧化作用消毒，仅能杀死外植体表面的少量细菌，效果跟75%酒精相似，将NaCLO与酒精组合，消毒效果欠佳。
参考文献
[1] 张涛，马海乐，钟慧慧.分光光度法测定辣木多糖含量[J].粮油食品科技，2003，12（1）：32-33.
[2] 赵燕南，王力舟.现代化妆品中的经典植物油——辣木籽油[J].中国化妆品：专业版，1997（3）：25.
[3] 王有琼，段琼芳，孙龙，等.辣木油浸提方法探讨[J].林业科技开发，2004（4）：12-13.
[4] RAJANGGAM J，AZAHAKIA MANAVALAN R S.辣木在南印度的生产及利用状况[J].印度科技，2000（4）：189.
[5] 刘昌芬.辣木的营养价值[J].热带农业科技，2004，27（1）：4-8.
[6] 陈惠民，周佳莹.植物中的钻石——高经济价值的辣木[M].台湾：商州出版社，2005：76.
[7] FOLKARD G，SUTHERLAND J.Moringa oleifera Lam：A tree and a litany of potential[J].Agroforestry Today，1996，8（3）：5-8.
[8] RAM J.Moringa：a highly nutritious vegetable tree，in Triades，technical bulletin NO.2[R].1994：12.
[9] CHING L S，MOHAMED S.Alpha.tocopherol content in 62 edible tropical plant[J].Agric Food Chem，2001（4）：101-105.
[10] CHURCH WORLD WORLD SERVICE，The Miracle tree：Moringa oleifera[EB/OL].http：//www.Moringa tree.Org/TMT nutrition.html.
[11] VLAHOV G，KIPRONO CHEPKWONY P，NDALUT P K.13C NMR characterization of triacylglycerols of Moringa oleifera seed oil：An “oleic vaccenic acid” oil[J].AGRIC Food Chem，2002，50（5）：970-975.
[12] LIMAYE D A，NIMBKAR A Y，JAM R，et al.Cardiovascular effects of the aqueous extract of Moringa pterygosperma[J].Phytother Research，1995，9（1）：37-40.
[13] RAMACHANDRAN C，PETER K V，GOPALAKRISHNAN P K.Drumstick（Moringa oleifera Lam）：A multipurpose Indian vegetable[J].Economic Botany，1980，34：276-283.
[14] 刘永红，李会珍.辣木的利用价值与栽培技术[J].福建热带科技，2003，9（2）：34-35.
[15] 刘昌芬.不同品种和产地辣木叶片营养成分含量[J].热带农业科技，2004（1）：1-2.
[16] 刘昌芬.辣木的研究现状及其开发前景[J].热带农业科技，2002，25（3）：20-24.
[17] 杨炎，刘昌芬，龙继明.不同栽培基质对辣木农艺性状的影响[J].热带农业科技，2014，37（2）：17-20.
[18] 罗云霞，陆斌，石卓功.辣木的特性与价值及其在云南引种发展的景况[J].西部林业科学，2005，35（4）：137-145.