【目的】对细菌Solitalea canadensis中编码β-N-乙酰氨基己糖苷酶的基因进行克隆,通过原核表达获得重组β-N-乙酰氨基己糖苷酶,并研究其酶学性质。【方法】以Solitalea canadensis基因组DNA为模板,使用加尾PCR的方法克隆编码β-N-乙酰氨基己糖苷酶的基因,构建含有组氨酸标签的重组表达载体,并将重组质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）中进行原核表达。重组蛋白经Ni-NTA纯化,以对硝基苯酚-β-乙酰氨基葡萄糖（pNP-β-Glc NAc）为底物研究其酶学性质,包括最适温度、最适p H以及金属离子和抑制剂的影响。【结果】从菌株Solitalea canadensis克隆得到了β-N-乙酰氨基己糖苷酶基因片段（Gene Bank:WP₀14682183.1）,全长2586 bp,重组表达所得蛋白表观分子量约为97 k Da,最适pH 6.0,最适温度42°C,但不稳定,半衰期小于5 min。该酶对十二烷基磺酸钠（SDS）敏感,活性受Triton X-100和尿素的抑制。此外二糖分子也能不同程度地抑制该重组酶的活性,特异性抑制剂PugNAc（O-（2-Acetamido-2-deoxy-D-glucopyranosylideneamino）N-phenylcarbamate）对该酶的IC₅₀为2μmol/L。该重组酶蛋白除能水解对硝基苯酚-β-乙酰氨基葡萄糖苷和对硝基苯酚-β-乙酰氨基半乳糖（pNP-β-GalNAc）外,还能对O-链聚糖核心结构Core Ⅱ末端的乙酰氨基葡萄糖进行水解。【结论】本文首次从Solitalea canadensis中克隆得到能水解末端β1-6连接的乙酰氨基葡萄糖而不能水解β1-4连接键的β-N-乙酰氨基己糖苷酶,并对其进行了酶学性质研究和底物特异性分析,为开发高效特异性强的糖链分析工具酶提供理论基础。