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【摘 要】氢气生物学效应对器官的保护作用集中在肝脏、心脏、肾、脑等脏器上，而对活性氧引起的生殖系统损伤，造成的精子密度、活率下降，诱发精子DNA发生氧化损伤保护作用国内外尚未见报道。本实验拟采用吸烟诱导动物体内活性氧含量增高和生殖系统损伤，研究氢气皮下注射对活性氧的清除从而保护动物的生殖功能和器官组织损伤。有望通过吸“气”保护生殖，提高男性生育力。
【关键词】氢气；皮下注射；生殖系统；保护作用
1.氢气生物学效应的研究现状
氢气是一种无色、无嗅、无味气体，常温下反应不活泼。在过去，大部分的生物学家认为，氢气属于生理性惰性气体，一直没有重视氢在高等生物体内的作用。1975年，有人曾在《科学》发表论文证明，连续呼吸8个大气压97.5%氢气（2.5%氧）14天，可有效治疗动物皮肤恶性黑色素瘤，并认为是通过抗氧化作用来实现的。[1]2001年，法国潜水医学家证明，呼吸8个大气压高压氢气可治疗肝曼森血吸虫感染引起的炎症反应，首次证明氢气具有抗炎作用，并提出氢气与羟自由基直接反应是治疗炎症损伤的基础。[2]2007年7月，日本医科大学太田成男教授在《自然-医学》中报道，动物呼吸2%的氢气就能有效清除自由基，显著改善脑缺血再灌注损伤，基础就是氢气在体内的选择性抗氧化作用。[3]该研究迅速引起广泛关注，并掀起研究氢气治疗疾病的热潮。上海第二军医大学孙学军等通过大量动物实验证明，呼吸2%氢可治疗新生儿脑缺血缺氧损伤，研究结果与日本学者的结果类似。[4] 并率先将氢气疗法引进国内，为国内研究氢气医学奠定了基础。目前，市场上已经有以抗氧化衰老为功效的氢气水等保健品出售。
氢气生物学效应对器官的保护作用集中在肝脏、心脏、肾、脑等脏器上，而对活性氧引起的生殖系统损伤，造成的精子密度、活率下降，诱发精子DNA发生氧化损伤保护作用却未见报道。
2.实验立论基础：
本实验在前人的基础上，拟观察氢气皮下注射通过有效的清除吸烟致生殖损伤的活性氧，从而对吸烟致雄性大鼠生殖系统损伤产生的保护作用，具体观察指标为大鼠的睾丸组织结构、阴茎海绵体、精子数和形态观察。检测血清和睾丸组织睾酮含量，测定抗氧化酶的活性，为进一步应用新型抗氧化剂治疗男性不育提供实验依据和理论基础。主要有以下四点设计：
1.高浓度活性氧（reactive oxygen species，ROS）可以造成精子密度、活率下降，诱发DNA发生氧化损伤。并且对组织形态有一定的损伤。
2.吸烟可以显著增加体内活性氧的产生
3.抗氧化剂可以纠正或减轻活性氧对精液和组织的损伤
4.氢气皮下注射可以选择性清除活性氧，抑制炎症反应和细胞凋亡，保护DNA
3.实验方法与观察指标：
研究方法：
1. 动物：清洁级Wistar大鼠40只，雄性，鼠龄6-8周，体重160g～200g。由成都中医药大学实验动物中心提供，室温20?C，适应性常规饲养1周后，随机分为四组
A：正常组：每天皮下注射0.2ml/kg氮气，自由喂食，饮水，人工喂养8周
B：吸烟组：被动吸烟每天四次，每次三十分钟。每天皮下注射0.2ml/kg氮气，自由喂食，饮水，人工喂养8周
C：吸烟+氢气皮下注射组：被动吸烟每天四次，每次三十分钟。每天皮下注射一次0.2ml/kg氢气自由喂食，饮水，人工喂养8周
D：正常+氢气皮下注射：每天皮下注射0.2ml/kg氢气，自由喂食，饮水，人工喂养8周
2. 大鼠解剖器官处理
一半：冷冻 5ml离心管
①左/右侧睾丸 另一半：放入4%的多聚甲醛溶液中 15ml管
一半：冷冻 2ml离心管
②左/右侧附睾 另一半：尾部用于精子活动率和计数
③前列腺、精囊放5ml离心管
④血液，抗凝管
研究指标：
①光镜和电镜下观察睾丸组织和阴茎海绵体
②精子计数
③精子形态异常的检查
④性激素睾酮的测定，酶联免疫吸附法（ELISA）
⑤SOD和MDA的测定，ELISA法
4.数据统计：采用SPSS13.0统计软件包进行
4，预期结果与预期结论：
预期结果：
1.光镜和电镜下观察睾丸组织和阴茎海绵体：异常情况：B组>C组>A组>D组
2.精子计数：D组>A组>C组>B组
3.精子形态异常的检查：B组>C组>A组>D组
4.性激素睾酮的测定，酶联免疫吸附法（ELISA）：D组>A组>C组>B组
5.SOD、MDA的测定，ELISA法：D组>A组>C组>B组
预期结论：氢气皮下注射对吸烟致雄性大鼠生殖系统损伤的保护作用。
参考文献：
[1] Eskenazi B，kidd SA，Marks AR，et al. 2005 Antioxidant intake is associated with semen quality in healthy men. Human Reproduction 20，1006-1012
[2] Tremellen K，Miari G，Froiland D，Thompson J 2007. A randomized control trial examining the effect of an antioxidant（Menevit）on pregnancy outcome during IVF-ICSI treatment. The Australian and New Zealand Journal of Obstetrics and Gynaecology. 47，216-221
[3] 揣云海，孙学军，蔡建明等.氢气生物学及其医学应用[J].生物物理学报.2012，28（9）：705—718
[4] 孙学军.氢气的选择性抗氧化[J].生物物理学报.2009，25（增刊）：123—124
【关键词】氢气；皮下注射；生殖系统；保护作用
1.氢气生物学效应的研究现状
氢气是一种无色、无嗅、无味气体，常温下反应不活泼。在过去，大部分的生物学家认为，氢气属于生理性惰性气体，一直没有重视氢在高等生物体内的作用。1975年，有人曾在《科学》发表论文证明，连续呼吸8个大气压97.5%氢气（2.5%氧）14天，可有效治疗动物皮肤恶性黑色素瘤，并认为是通过抗氧化作用来实现的。[1]2001年，法国潜水医学家证明，呼吸8个大气压高压氢气可治疗肝曼森血吸虫感染引起的炎症反应，首次证明氢气具有抗炎作用，并提出氢气与羟自由基直接反应是治疗炎症损伤的基础。[2]2007年7月，日本医科大学太田成男教授在《自然-医学》中报道，动物呼吸2%的氢气就能有效清除自由基，显著改善脑缺血再灌注损伤，基础就是氢气在体内的选择性抗氧化作用。[3]该研究迅速引起广泛关注，并掀起研究氢气治疗疾病的热潮。上海第二军医大学孙学军等通过大量动物实验证明，呼吸2%氢可治疗新生儿脑缺血缺氧损伤，研究结果与日本学者的结果类似。[4] 并率先将氢气疗法引进国内，为国内研究氢气医学奠定了基础。目前，市场上已经有以抗氧化衰老为功效的氢气水等保健品出售。
氢气生物学效应对器官的保护作用集中在肝脏、心脏、肾、脑等脏器上，而对活性氧引起的生殖系统损伤，造成的精子密度、活率下降，诱发精子DNA发生氧化损伤保护作用却未见报道。
2.实验立论基础：
本实验在前人的基础上，拟观察氢气皮下注射通过有效的清除吸烟致生殖损伤的活性氧，从而对吸烟致雄性大鼠生殖系统损伤产生的保护作用，具体观察指标为大鼠的睾丸组织结构、阴茎海绵体、精子数和形态观察。检测血清和睾丸组织睾酮含量，测定抗氧化酶的活性，为进一步应用新型抗氧化剂治疗男性不育提供实验依据和理论基础。主要有以下四点设计：
1.高浓度活性氧（reactive oxygen species，ROS）可以造成精子密度、活率下降，诱发DNA发生氧化损伤。并且对组织形态有一定的损伤。
2.吸烟可以显著增加体内活性氧的产生
3.抗氧化剂可以纠正或减轻活性氧对精液和组织的损伤
4.氢气皮下注射可以选择性清除活性氧，抑制炎症反应和细胞凋亡，保护DNA
3.实验方法与观察指标：
研究方法：
1. 动物：清洁级Wistar大鼠40只，雄性，鼠龄6-8周，体重160g～200g。由成都中医药大学实验动物中心提供，室温20?C，适应性常规饲养1周后，随机分为四组
A：正常组：每天皮下注射0.2ml/kg氮气，自由喂食，饮水，人工喂养8周
B：吸烟组：被动吸烟每天四次，每次三十分钟。每天皮下注射0.2ml/kg氮气，自由喂食，饮水，人工喂养8周
C：吸烟+氢气皮下注射组：被动吸烟每天四次，每次三十分钟。每天皮下注射一次0.2ml/kg氢气自由喂食，饮水，人工喂养8周
D：正常+氢气皮下注射：每天皮下注射0.2ml/kg氢气，自由喂食，饮水，人工喂养8周
2. 大鼠解剖器官处理
一半：冷冻 5ml离心管
①左/右侧睾丸 另一半：放入4%的多聚甲醛溶液中 15ml管
一半：冷冻 2ml离心管
②左/右侧附睾 另一半：尾部用于精子活动率和计数
③前列腺、精囊放5ml离心管
④血液，抗凝管
研究指标：
①光镜和电镜下观察睾丸组织和阴茎海绵体
②精子计数
③精子形态异常的检查
④性激素睾酮的测定，酶联免疫吸附法（ELISA）
⑤SOD和MDA的测定，ELISA法
4.数据统计：采用SPSS13.0统计软件包进行
4，预期结果与预期结论：
预期结果：
1.光镜和电镜下观察睾丸组织和阴茎海绵体：异常情况：B组>C组>A组>D组
2.精子计数：D组>A组>C组>B组
3.精子形态异常的检查：B组>C组>A组>D组
4.性激素睾酮的测定，酶联免疫吸附法（ELISA）：D组>A组>C组>B组
5.SOD、MDA的测定，ELISA法：D组>A组>C组>B组
预期结论：氢气皮下注射对吸烟致雄性大鼠生殖系统损伤的保护作用。
参考文献：
[1] Eskenazi B，kidd SA，Marks AR，et al. 2005 Antioxidant intake is associated with semen quality in healthy men. Human Reproduction 20，1006-1012
[2] Tremellen K，Miari G，Froiland D，Thompson J 2007. A randomized control trial examining the effect of an antioxidant（Menevit）on pregnancy outcome during IVF-ICSI treatment. The Australian and New Zealand Journal of Obstetrics and Gynaecology. 47，216-221
[3] 揣云海，孙学军，蔡建明等.氢气生物学及其医学应用[J].生物物理学报.2012，28（9）：705—718
[4] 孙学军.氢气的选择性抗氧化[J].生物物理学报.2009，25（增刊）：123—124