论文部分内容阅读
摘要 [目的]从山葡萄北冰红中克隆耐寒基因COR413，并对其功能进行生物信息学分析。[方法]利用RT-PCR法克隆山葡萄北冰红基因COR413，并利用生物信息学对其进行分析。[结果]它包括630 bp完整的开放阅读框，推测编码210个氨基酸，蛋白的分子量（MW）为59.18 kD，等电点（pI）值为10.74。其蛋白结构以α-螺旋、延伸链为主，其次为无规则卷曲，β-转角所占比例最少，含有4个跨膜结构域。多重序列比对表明VvCOR413-I1与其他植物COR413的氨基酸序列相似性为63.00%～68.33%。[结论]该研究为深入了解VvCOR413-I1功能奠定了基础。
关键词 冷适应蛋白基因（COR413）；山葡萄北冰红；克隆；生物信息学分析
中图分类号 S188 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2018）14-0109-04
Cloning and Bioinformatic Analysis of VvCOR413-I1 Gene from Beibinghong Amur Grape
WANG Xuejuan （College of Life Science，Inner Mongolia University for Nationalities，Tongliao，Inner Mongolia 028000）
Abstract [Objective]The coldtolerant gene COR413 was cloned from the Beibinghong Amur grape， and its function was inferred through bioinformatics analysis.[Method]The RTPCR method was used to clone COR413， a coldtolerant gene from the Beibinghong Amur grape， and its molecular characteristics were analyzed by bioinformatics to infer the function of COR413 gene.[Result]The ORF of COR413 was 630 bp and the deduced amino acid sequence was 230 amino acids.Furthermore，its protein had a MW of 59.18 kD and an isoelectric point （pI） of 10.74. The structure of the protein was dominated by αhelix and elongation chain， followed by random coil，the proportion of βturn was the smallest， containing 4 transmembrane domains.Multiple sequence alignment showed that the amino acid sequence similarity of COR413 with other plants was 63.00% to 68.33%.[Conclusion]The study laid the foundation for an indepth understanding of VvCOR413I1 function.
Key words Coldregulated gene （COR413）；Beibinghong Amur grape；Clone；Bioinformatic analysis
溫度胁迫是重要的非生物胁迫因子之一，其对植物的生长发育、花期、果期等产生重要的影响。植物接受不利温度的逆境信号后，通过信号传导途径，调节细胞内胁迫蛋白的表达。冷适应蛋白（coldregulated， COR413）基因作为植物特有的一类低温胁迫响应功能基因，在抗寒过程中发挥重要作用。冷驯化拟南芥转录组研究表明，COR413基因受低温调控，被称为低温诱导基因[1-2]。在植物COR413基因中含有CRT元件，CRT元件与CBF相互结合后引起COR413的表达，但是CBF的调控受到ICE的调控，ICE是一种组成型表达的蛋白质，但是蛋白质的泛素化是通过磷酸化来进行识别和调控的[3-4]。植物耐寒COR413已在多种植物中被克隆出来，并进行了功能验证。植物耐寒分子机制是一个复杂的过程，由多个基因协同作用在耐寒信号通路以抵御冷害，但有报道表明，单转COR413基因也能提高植株的耐寒性，如罂粟、菠菜、播娘篙等[5-7]。笔者以山葡萄北冰红为材料，利用RT-PCR扩增技术，获取其耐寒基因VvCOR413-I1，并进行生物信息学分析，为研究其功能和耐寒分子育种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料 取山葡萄北冰红新鲜叶片为供试材料。Ex Taq DNA聚合酶、克隆载体PMD18-T、胶回收试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司，感受态细胞JM109保存于内蒙古民族大学植物生物技术实训室，其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 山葡萄北冰红总RNA的提取及引物设计。使用Trizol提取法提取总RNA，几乎没有DNA和蛋白质污染，其纯度较高，具有较好的效果。根据葡萄基因组（https：//phytozome.jgi.doe.gov/ pz/portal.html）设计特异性上下游引物，并命名为VvCOR413-I1-F和VvCOR413-I1-R（表1）。
1.2.2 VvCOR413-I1全长cDNA的克隆。叶片总RNA提取及cDNA第一链合成严格按照试剂盒说明书进行操作。以cDNA为模板，利用Ex-Taq Buffer，Ex-Taq，dNTP Mixture （2.5 mmol/L each）和引物VvCOR413-I1-F、VvCOR413-I1-R扩增VvCOR413-I1全长。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s， 55 ℃ 40 s， 72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 10 min。反应产物通过1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，在凝胶成像系统下观察分析并拍照。PCR产物用北京索莱宝科技有限公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化，克隆载体选用pMD18-T Vector，从-20 ℃冰箱中取出目的片段，在冰盒上融化后与克隆载体连接，反应条件：16 ℃ 9 h。取200 μL大肠杆菌感受态细胞与10 μL重组质粒于同一试管中，用移液器轻轻混匀，将离心管至于冰水浴中30 min，42 ℃温水浴90 s，冰水浴5 min，37 ℃温水浴5 min，然后加入800 μL液体LB培养基，在200 r/min的条件下，保持37 ℃不断摇菌2～3 h。将菌落PCR（反应体系和条件同VvCOR基因克隆）和酶切验证正确的阳性克隆送至北京华大基因测序。 1.2.3 VvCOR413-I1生物信息学分析。对测序结果进行分析，确定克隆获得VvCOR413-I1基因cDNA序列完整开放阅读框。利用TMHMM、SOPMA、NetPhos3.1 Server等生物学软件进行生物信息学分析。
2 结果与分析
2.1 山葡萄北冰红叶片总RNA活性的检测 将提取好的总RNA用DEPC水进行10倍稀释，然后通过琼脂糖凝胶电泳（图1），并检测其纯度OD260/OD280=2.10，其纯度较好，可满足下一步试验要求。
2.2 VvCOR413-I1克隆
采用RT-PCR法克隆葡萄VvCOR413-I1，利用设计的全长特异性引物，扩增得其cDNA全长633 bp（图2）。
2.3 VvCOR413-I1鉴定
挑取阳性菌进行PCR鉴定，同时提取阳性菌的质粒，进行双酶切，结果见图3、4。从图3、4可看出，菌液PCR和双酶切电泳结果显示条带都为650 bp左右，与克隆结果一致，推断VvCOR413-I1成功导入大肠杆菌感受态中，并与克隆载体构建成功。
2.4 葡萄VvCOR基因生物信息学分析
2.4.1 VvCOR413-I1序列分析。利用DNAMAN软件对获得的VvCOR413-I1全长序列进行分析，包括630 bp完整的开放阅读框，可推测编码210个氨基酸的多肽，分子量为59.18 kD，等电点（pI）值为10.74，pH =7.0时电荷为13.05。利用NCBI的Conserved Domains （http：//www.ncbi.Nlm.nih. gov/ Structure/cdd/wrpsb/cgi）预测基因保守区，结果表明VvCOR413-I1含有蛋白家族保守区，表明该蛋白与COR413蛋白家族具有相似的功能（图5）。利用NetPhos3.1 Server对VvCOR413-I1氨基酸序列分析表明，它含有13个Ser、5个Thr、1个Tyr为磷酸化结合位点（图6）。植物受到胁迫时，VvCOR413-I1磷酸化快速直接参与酶的作用机制，并介导蛋白活性，以应对不利的生存条件。
2.4.2 VvCOR413-I1编码的氨基酸序列同源性比对。利用DNAMAN软件对VvCOR413-I1与其他植物的COR413氨基酸序列进行对比（图7）。结果表明，VvCOR413-I1与其他植物的COR413蛋白同源性均为63.00%以上，其中与土瓶草的COR413蛋白的同源性最高，为68.33%。
2.4.3 VvCOR413-I1结构预测与分析。运用DNAMAN和SOPMA软件预测 VvCOR413-I1蛋白的二级结构，表明该蛋白约含39.05%的α-螺旋，30.00%的延伸链，8.10%的β-转角，22.86%的无规卷曲（图8）。利用软件TMHMM对
VvCOR413-I1蛋白的氨基酸序列进行跨膜区的结构分析，结果表明，VvCOR413-I1的氨基酸序列中共有4个跨膜结构区（图9），而且其4个跨膜结构域与其他植物的COR413蛋白高度相似。VvCOR413-I1蛋白的结构域分析表明，其含有植物耐寒蛋白的COR413結构域和该家族的结构域结构，并存在4个跨膜结构与TMHMM分析结构一致（图10）。
3 结论与讨论
利用RT-PCR的方法成功克隆了VvCOR413-I1全长，其包括630 bp完整的开放阅读框，推测编码230个氨基酸。VvCOR413-I1蛋白的分子量（MW）为59.18 kD，等电点（pI）值为10.74，含有4个跨膜结构域。多重序列比对表明VvCOR413-I1与其他植物COR413蛋白的氨基酸一致性为63.00%～68.33%。
随着植物分子生物学技术的快速发展，对植物COR413基因及其应对冷、寒逆境胁迫应答方面研究较多，且对COR413蛋白功能研究及耐寒分子机制探索有了突破性进 展。对拟南芥耐寒COR413基因的研究表明，CBF基因表达 可以调节COR基因的表达能力，同时COR基因的启动子含有CRT/DRE元件，通过COR413基因自身表达和联动表达模式，提高拟南芥的耐寒性[8]。与此同时，在山葡萄COR413基因家族中已发现4个成员，通过耐寒试验研究表明，COR413基因家族具有提高植物耐寒能力的功能，但不同种间表达量存在差异[9]。笔者对山葡萄北冰红的VvCOR413-I1基因进行克隆，并在分子水平上对其特性进行分析，为研究其功能和利用基因工程手段培育葡萄耐寒品种奠定了基础。
参考文献
[1]
龚映雪.植物响应温度胁迫蛋白质组学研究进展[J].安徽农业科学，2010，38（32）：18038-18040.
[2] 缪嘉航.植物COR抗寒基因的转入研究[J].生物技术世界，2016（5）：35，38.
[3] 黄永会，刘永翔，朱英，等.COR基因在植物抗寒基因工程中的作用[J].贵州农业科学，2014，42（12）：37-42.
[4] 李志友.COR和CBF3基因导入番茄的研究[D].重庆：西南大学，2007.
[5] 陆艳梅，张金文，魏玉洁，等.罂粟COR和BBE基因RNAi载体构建及烟草转化[J].药学学报，2013，48（7）：1169-1177.
[6] 张腾国，郭艳峰，陈琼琼，等.油菜COR基因的克隆及原核表达[J].甘肃农业科技，2015（4）：1-4.
[7] 李良. 播娘蒿抗寒基因COR的克隆及其生物信息学分析与表达研究[D].成都：四川大学，2005.
[8] 吴楚，王政权.拟南芥中CBF对COR基因表达的调控[J].植物生理学通讯，2001，37（4）：365-368.
[9] 丁小玲，张宁波，焦淑珍，等.山葡萄COR413家族基因克隆及其参与低温胁迫的表达分析[J].农业生物技术学报，2017，25（3）：366-377.
关键词 冷适应蛋白基因（COR413）；山葡萄北冰红；克隆；生物信息学分析
中图分类号 S188 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2018）14-0109-04
Cloning and Bioinformatic Analysis of VvCOR413-I1 Gene from Beibinghong Amur Grape
WANG Xuejuan （College of Life Science，Inner Mongolia University for Nationalities，Tongliao，Inner Mongolia 028000）
Abstract [Objective]The coldtolerant gene COR413 was cloned from the Beibinghong Amur grape， and its function was inferred through bioinformatics analysis.[Method]The RTPCR method was used to clone COR413， a coldtolerant gene from the Beibinghong Amur grape， and its molecular characteristics were analyzed by bioinformatics to infer the function of COR413 gene.[Result]The ORF of COR413 was 630 bp and the deduced amino acid sequence was 230 amino acids.Furthermore，its protein had a MW of 59.18 kD and an isoelectric point （pI） of 10.74. The structure of the protein was dominated by αhelix and elongation chain， followed by random coil，the proportion of βturn was the smallest， containing 4 transmembrane domains.Multiple sequence alignment showed that the amino acid sequence similarity of COR413 with other plants was 63.00% to 68.33%.[Conclusion]The study laid the foundation for an indepth understanding of VvCOR413I1 function.
Key words Coldregulated gene （COR413）；Beibinghong Amur grape；Clone；Bioinformatic analysis
溫度胁迫是重要的非生物胁迫因子之一，其对植物的生长发育、花期、果期等产生重要的影响。植物接受不利温度的逆境信号后，通过信号传导途径，调节细胞内胁迫蛋白的表达。冷适应蛋白（coldregulated， COR413）基因作为植物特有的一类低温胁迫响应功能基因，在抗寒过程中发挥重要作用。冷驯化拟南芥转录组研究表明，COR413基因受低温调控，被称为低温诱导基因[1-2]。在植物COR413基因中含有CRT元件，CRT元件与CBF相互结合后引起COR413的表达，但是CBF的调控受到ICE的调控，ICE是一种组成型表达的蛋白质，但是蛋白质的泛素化是通过磷酸化来进行识别和调控的[3-4]。植物耐寒COR413已在多种植物中被克隆出来，并进行了功能验证。植物耐寒分子机制是一个复杂的过程，由多个基因协同作用在耐寒信号通路以抵御冷害，但有报道表明，单转COR413基因也能提高植株的耐寒性，如罂粟、菠菜、播娘篙等[5-7]。笔者以山葡萄北冰红为材料，利用RT-PCR扩增技术，获取其耐寒基因VvCOR413-I1，并进行生物信息学分析，为研究其功能和耐寒分子育种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料 取山葡萄北冰红新鲜叶片为供试材料。Ex Taq DNA聚合酶、克隆载体PMD18-T、胶回收试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司，感受态细胞JM109保存于内蒙古民族大学植物生物技术实训室，其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 山葡萄北冰红总RNA的提取及引物设计。使用Trizol提取法提取总RNA，几乎没有DNA和蛋白质污染，其纯度较高，具有较好的效果。根据葡萄基因组（https：//phytozome.jgi.doe.gov/ pz/portal.html）设计特异性上下游引物，并命名为VvCOR413-I1-F和VvCOR413-I1-R（表1）。
1.2.2 VvCOR413-I1全长cDNA的克隆。叶片总RNA提取及cDNA第一链合成严格按照试剂盒说明书进行操作。以cDNA为模板，利用Ex-Taq Buffer，Ex-Taq，dNTP Mixture （2.5 mmol/L each）和引物VvCOR413-I1-F、VvCOR413-I1-R扩增VvCOR413-I1全长。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s， 55 ℃ 40 s， 72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 10 min。反应产物通过1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，在凝胶成像系统下观察分析并拍照。PCR产物用北京索莱宝科技有限公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化，克隆载体选用pMD18-T Vector，从-20 ℃冰箱中取出目的片段，在冰盒上融化后与克隆载体连接，反应条件：16 ℃ 9 h。取200 μL大肠杆菌感受态细胞与10 μL重组质粒于同一试管中，用移液器轻轻混匀，将离心管至于冰水浴中30 min，42 ℃温水浴90 s，冰水浴5 min，37 ℃温水浴5 min，然后加入800 μL液体LB培养基，在200 r/min的条件下，保持37 ℃不断摇菌2～3 h。将菌落PCR（反应体系和条件同VvCOR基因克隆）和酶切验证正确的阳性克隆送至北京华大基因测序。 1.2.3 VvCOR413-I1生物信息学分析。对测序结果进行分析，确定克隆获得VvCOR413-I1基因cDNA序列完整开放阅读框。利用TMHMM、SOPMA、NetPhos3.1 Server等生物学软件进行生物信息学分析。
2 结果与分析
2.1 山葡萄北冰红叶片总RNA活性的检测 将提取好的总RNA用DEPC水进行10倍稀释，然后通过琼脂糖凝胶电泳（图1），并检测其纯度OD260/OD280=2.10，其纯度较好，可满足下一步试验要求。
2.2 VvCOR413-I1克隆
采用RT-PCR法克隆葡萄VvCOR413-I1，利用设计的全长特异性引物，扩增得其cDNA全长633 bp（图2）。
2.3 VvCOR413-I1鉴定
挑取阳性菌进行PCR鉴定，同时提取阳性菌的质粒，进行双酶切，结果见图3、4。从图3、4可看出，菌液PCR和双酶切电泳结果显示条带都为650 bp左右，与克隆结果一致，推断VvCOR413-I1成功导入大肠杆菌感受态中，并与克隆载体构建成功。
2.4 葡萄VvCOR基因生物信息学分析
2.4.1 VvCOR413-I1序列分析。利用DNAMAN软件对获得的VvCOR413-I1全长序列进行分析，包括630 bp完整的开放阅读框，可推测编码210个氨基酸的多肽，分子量为59.18 kD，等电点（pI）值为10.74，pH =7.0时电荷为13.05。利用NCBI的Conserved Domains （http：//www.ncbi.Nlm.nih. gov/ Structure/cdd/wrpsb/cgi）预测基因保守区，结果表明VvCOR413-I1含有蛋白家族保守区，表明该蛋白与COR413蛋白家族具有相似的功能（图5）。利用NetPhos3.1 Server对VvCOR413-I1氨基酸序列分析表明，它含有13个Ser、5个Thr、1个Tyr为磷酸化结合位点（图6）。植物受到胁迫时，VvCOR413-I1磷酸化快速直接参与酶的作用机制，并介导蛋白活性，以应对不利的生存条件。
2.4.2 VvCOR413-I1编码的氨基酸序列同源性比对。利用DNAMAN软件对VvCOR413-I1与其他植物的COR413氨基酸序列进行对比（图7）。结果表明，VvCOR413-I1与其他植物的COR413蛋白同源性均为63.00%以上，其中与土瓶草的COR413蛋白的同源性最高，为68.33%。
2.4.3 VvCOR413-I1结构预测与分析。运用DNAMAN和SOPMA软件预测 VvCOR413-I1蛋白的二级结构，表明该蛋白约含39.05%的α-螺旋，30.00%的延伸链，8.10%的β-转角，22.86%的无规卷曲（图8）。利用软件TMHMM对
VvCOR413-I1蛋白的氨基酸序列进行跨膜区的结构分析，结果表明，VvCOR413-I1的氨基酸序列中共有4个跨膜结构区（图9），而且其4个跨膜结构域与其他植物的COR413蛋白高度相似。VvCOR413-I1蛋白的结构域分析表明，其含有植物耐寒蛋白的COR413結构域和该家族的结构域结构，并存在4个跨膜结构与TMHMM分析结构一致（图10）。
3 结论与讨论
利用RT-PCR的方法成功克隆了VvCOR413-I1全长，其包括630 bp完整的开放阅读框，推测编码230个氨基酸。VvCOR413-I1蛋白的分子量（MW）为59.18 kD，等电点（pI）值为10.74，含有4个跨膜结构域。多重序列比对表明VvCOR413-I1与其他植物COR413蛋白的氨基酸一致性为63.00%～68.33%。
随着植物分子生物学技术的快速发展，对植物COR413基因及其应对冷、寒逆境胁迫应答方面研究较多，且对COR413蛋白功能研究及耐寒分子机制探索有了突破性进 展。对拟南芥耐寒COR413基因的研究表明，CBF基因表达 可以调节COR基因的表达能力，同时COR基因的启动子含有CRT/DRE元件，通过COR413基因自身表达和联动表达模式，提高拟南芥的耐寒性[8]。与此同时，在山葡萄COR413基因家族中已发现4个成员，通过耐寒试验研究表明，COR413基因家族具有提高植物耐寒能力的功能，但不同种间表达量存在差异[9]。笔者对山葡萄北冰红的VvCOR413-I1基因进行克隆，并在分子水平上对其特性进行分析，为研究其功能和利用基因工程手段培育葡萄耐寒品种奠定了基础。
参考文献
[1]
龚映雪.植物响应温度胁迫蛋白质组学研究进展[J].安徽农业科学，2010，38（32）：18038-18040.
[2] 缪嘉航.植物COR抗寒基因的转入研究[J].生物技术世界，2016（5）：35，38.
[3] 黄永会，刘永翔，朱英，等.COR基因在植物抗寒基因工程中的作用[J].贵州农业科学，2014，42（12）：37-42.
[4] 李志友.COR和CBF3基因导入番茄的研究[D].重庆：西南大学，2007.
[5] 陆艳梅，张金文，魏玉洁，等.罂粟COR和BBE基因RNAi载体构建及烟草转化[J].药学学报，2013，48（7）：1169-1177.
[6] 张腾国，郭艳峰，陈琼琼，等.油菜COR基因的克隆及原核表达[J].甘肃农业科技，2015（4）：1-4.
[7] 李良. 播娘蒿抗寒基因COR的克隆及其生物信息学分析与表达研究[D].成都：四川大学，2005.
[8] 吴楚，王政权.拟南芥中CBF对COR基因表达的调控[J].植物生理学通讯，2001，37（4）：365-368.
[9] 丁小玲，张宁波，焦淑珍，等.山葡萄COR413家族基因克隆及其参与低温胁迫的表达分析[J].农业生物技术学报，2017，25（3）：366-377.