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[摘要]目的：研究青蒿琥酯抑制人增生性瘢痕成纤维细胞（HSFBs）增殖作用机制及miR-21所起的作用，为青蒿琥酯抑制皮肤瘢痕增生提供依据。方法：原代分离人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞，分别使用100、200、300、500 μmol/L的青蒿琥酯处理24h，采用CCK8检细胞的增值，实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测miR-21的表达情况。调控青蒿琥酯干预的HSFBs中的miR-21的表达，通过qRT-PCR和WB检测细胞中结缔组织生长因子（CTGF）以及机制金属蛋白酶1（MMP-1）的表达。结果：青蒿琥酯能抑制HSFBs的增值，并且抑制miR-21的表达。HSFBs细胞使用mimics处理，能显著降低青蒿琥酯对HSFBs的增值抑制作用，同时CTGF的表达升高，而MMP-I的表达降低。结论：青蒿琥酯可能通过调控miR-21的表达来抑制HSFBs的增值。
[关键词]增生性瘢痕；成纤维细胞；青蒿琥酯；miR-21
[中图分类号]R619+.6 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2017）03-0080-04
皮肤增生性瘢痕是病理性瘢痕的主要类型之一，常常给人们带来瘙痒，病痛甚至活动障碍等多种并发症。降低了人类正常的生活质量，特别是形成于面部的瘢痕严重影响美观，给患者带来很大的精神压力。增生性瘢痕主要组织学特点是成纤维细胞的增加，细胞外基质的过度沉积以及胶原纤维紊乱无章的排列。
青蒿琥酯又称青蒿酯，是由菊科植物黄花蒿叶提取的倍半萜烯的一种内过氧化物。长期以来，人们一直用它作为一种治疗疟疾的传统中药。青蒿琥酯及其衍生物被世界卫生组织列为治疗疟疾的首选药物。它能特异性地抑制恶性疟原虫内质网钙腺苷三磷酸酶的活性。除了抗疟活性外，青蒿琥酯及其衍生物在一些自身免疫疾病模型中也表现出潜在的免疫抑制活性，例如：系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎和自身免疫脑脊髓炎。近年来，人们发现一定剂量的青蒿琥酯可以抑制HSFBs的增值，诱导其凋亡。
MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，大小约为20～25个核苷酸。miRNAs可调节细胞生长和组织分化，与生命过程中发育、疾病密切相关。有研究显示，miR-21能促进纤维化的发生，可以通过促进细胞外基质的沉积从而促进纤维化的出现。慕生枝等人指出，下调HSFBs中miR-21的表达可以抑制HSFBs的增值。本研究通过體外培养HSFBs，采用不同浓度的青蒿琥酯进行干预，检测其对HSFBs增值的影响。同时通过抑制HSFBs中miR-21的表达，再一次验证青蒿琥酯对HSFBs的增值影响，探讨青蒿琥酯对HSFBs抑制作用可能的机制，为开发抗瘢痕药剂提供实验依据。
1材料
1.1主要仪器：TS-IOOF倒置显微镜，日本Nikon公司；全自动多功能型酶标仪，美国BIO-RAD公司，实时定量PCR扩增仪，美国ABI公司。
1.2主要试剂：青蒿琥酯，纯度99.99%，桂林南药股份公司；DMEM培养基、胎牛血清，美国Gibico公司；CCK8，美国Sigma公司；鼠抗人波形蛋白、鼠抗人CTGF单克隆抗体、鼠抗人Ⅰ型胶原多克隆抗体、鼠抗人GAPDH单克隆抗体，武汉博士德公司；RNA提取试剂盒，逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒，日本Takara公司；miR-21 mimics，上海吉码生物。
2方法
2.1 HSFBs的原代培养及鉴定：瘢痕标本来源于广州医学院附属第一医院烧伤整形科外科手术切除的增生性瘢痕，取材前经患者知情同意。组织采纳的标准为3年内没有接受抗瘢痕治疗，没有系统性疾病。采用组织块法进行原代培养。20%胎牛血清的DMEM培养基按照1：3反复传代纯化成纤维细胞。原代细胞、传代细胞均通过倒置显微镜进行观察。取3代成纤维细胞，制备细胞爬片，4%多聚甲醛固定，进行波形蛋白免疫组化染色鉴定。
2.2 CCK8检测HSFBs增值：细胞弃去培养液，用PBS洗涤细胞2次，弃去PBS，加入0.25%胰酶，在显微镜下观察，当胞质回缩，细胞之间不再连接成片，加入新鲜的完全培养基，制备细胞悬液；然后调整细胞密度至1×105/μl，取100 μl细胞悬液加入96孔板，即每孔种1×104个细胞，放入培养箱培养，常规培养；分别加入100、200、300、500μmol/L处理HSFBs，对照组加入培养基，继续培养24h。细胞处理结束的前4h，吸去培养液，按每lml完全培养基加入100 μl CCK-8将二者混合均匀后，每孔加入100 μl的CCK-8混合液，避免产生气泡，将培养板放到培养箱内孵育4h，4h后，将96孔板中的液体移至酶标板中，在492nm波长下测定吸光度（A）值。
2.3 qRT-PCR检测miR-21、CTGF及MMP1mRNA的表达：各组经处理后的细胞根据RNA快速提取试剂盒说明书步骤提取细胞总RNA。按照Takara RNA PCR Kit（AMY）Vet.3.0说明书操作进行反转录。用RT试剂盒将RNA反转录为cDNA，然后以cDNA的第1链作为模板进行PCR扩增。PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析、DNA吸光度扫描检测；显色条带图像分析系统（Alpha Imager 2000）检测其积分吸光度值，与内参GAPDH条带的比值为mRNA表达水平参数。miR-21的基因表达检测是以U6小RNA为内参。所用引物均由上海生工有限公司合成。具体引物序列表1。
2.4免疫荧光检测波形蛋白：细胞在盖片上生长融合到95%～100%时，用1×PBS洗3次，每次10min；4%的甲醛室温固定25min；O.2%TritonX-100透化2～5min；5%牛血清白蛋白（BSA）室温封闭30min，加一抗波形蛋白（用1%BSA按照1：1000稀释）4℃过夜，1×PBS洗涤3次，每次10min；加二抗IgG（用1%BSA按照1：1000稀释）暗室避光30min，95%甘油封片。荧光显微镜下观察结果并拍摄图片。 2.5 Western blot检测CTGF和MMP1的表达：每25cm2细胞加入蛋白裂解液200 μl，冰上裂解细胞30min，离心收集总蛋白。常规聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜，5%脱脂奶粉室温下封闭2h，4℃孵育一抗过夜（CTGF1：500稀释，Ⅰ型胶原1：1000稀释），室温下孵育二抗30min（1：5000稀释）；GAPDH作为内参照（1：10000稀释）。暗室内ECL化学发光及显影、定影。
2.6数据分析：所有数据采用SPSS13.0软件处理，计量数据以均数±标准（x±s）表示，统计学分析多样本比较采用单因素方差分析（one-wayANOVA），两两比较采用LSD法，以P<0.05为差异具有统计学意义。
3结果
3.1 HSFBs原代分离及鉴定结果：培养5～7d可见组织块周围有细小呈长梭状贴壁细胞，之后梭形细胞快速增值，20d左右可长满25cm2培养瓶，生长状态如图1A；传至第三代，可以获得较纯的成纤维细胞，所有细胞胞质均呈抗波形蛋白染色阳性（图1B）。
3.2青蒿琥酯对HSFBs的增值及miR-21的表达的影响：100、200、300、500μmol/L的青蒿琥酯处理HSFBs，CCK8结果显示，随着青蒿琥酯浓度的增加，对HSFBs增值的抑制作用增加，且与对照组相比，48h后，300及500μmol/L青蒿琥酯处理组有显著性差异（P<0.05）（图2A）。miR-21的表达也明显下降，且200、300、500μmol/L的青蒿琥酯处理组与对照组相比，有显著性差异（P<0.05）（图2B）。使用300μmol/L的青蒿琥酯进行以下实验。
3.3上调miR-21后，青蒿琥酯对HSFBs增值抑制作用鉴定：用青蒿琥酯处理HSFBs，处理后将细胞分成3组，分别为对照组，mimics NC组和mimics组。分别对三组细胞进行qRT-PCR，wB和CCK8检测。与对照组和mimics NC相比，mimics组miR-21（图3A）和CTGF mRNA（图3B）表达上升，而MMP-1 mRNA（图3C）的表达下降，且均有统计学意义（P<0.05）。与对照组和mimics NC相比，mimics组CTGF的蛋白表达上升，MMP-1蛋白表达下降（图3D）。与对照组和mimics NC相比，mimics组HSFBs增值抑制作用降低，且48h后具有统计学意义（P<0.05）。
4讨论
增生性瘢痕是人体对创伤产生过度愈合反应的结果，是人体烧伤、外伤或者炎症一种过度的皮肤纤维增生性疾病，成纤维细胞增殖旺盛、细胞外基质中的胶原、糖蛋白等过度的沉积，胶原蛋白排列紊乱为主要的病理特征。而人们认为其可能与异物反应、胶原降解、免疫反应异常有关。成纤维细胞在伤口上皮化以后继续旺盛增殖且凋亡过程发生抑制、胶原等细胞外基质合成与降解失衡、部分生长因子的大量产生和持续性存在，这三者密切关联构成了增生性瘢痕形成的生物学基础。增生性瘢痕与正常皮肤的成纤维细胞的形态结构不同，表现为纤维细胞持续旺盛同时大量分泌胶原等细胞外基质，使组织体积不断的增大引起副作用，比如功能型障碍。所以成纤维细胞的生长异常，被认为是瘢痕形成过程中的主要因素。
miRNA是一种长度约为19-22nt的非编码RNA，调节正常生理过程及病理过程，如器官的发育，创伤的愈合以及肿瘤的发生，几乎参与调控细胞活动的各个环节。有报道指出，miR-21参与间质纤维化和心肌肥厚的成纤维细胞中呈现高表达的状态，miRNA-21的表达失调也可能调控肺纤维化的。本研究发现，使用青蒿琥酯可以降低miR-21的表达以及降低HSFBs的增殖。而通过加入miR-21minics可以降低青蒿琥酯的作用。這表明通过青蒿琥酯降低miR-21的表达能够抑制瘢痕的形成。
Ⅰ型胶原的过度合成和降解减少是增生性瘢痕形成的原因之一。抑制成纤维细胞中胶原蛋白的形成可以明显地抑制瘢痕增生。而基质金属蛋白酶（MMPs）可以调控细胞外基质的持续降解。MMP-1能够破坏胶原热稳定性。组织中的MMP-1含量的多少级活性的强弱和细胞外基质的降解程度有关。本研究发现，提高miR-21的含量可以降低青蒿琥酯抑制HSFBs的增殖，而此过程与CTGF的表达升高和MMP-1的表达降低有关。从而推测青蒿琥酯可能一方面通过下降miR-21的表达而影响CTGF的表达，与此同时，通过上调MMP-1的表达，加速胶原的降解。
综上所述，本实验揭示青蒿琥酯可以抑制HSFBs增殖，通过下调miR-21的表达，而通过上调miR-21的含量，可以上调CTGF的表达而降低MMP-1的表达。从而增加细胞外胶原基质的沉积，增大HSFBs的增殖。所以miR-21对瘢痕的发生起着至关重要的作用，这对于临床上应用miR-21靶向分子治疗增生性瘢痕提供了理论基础。
[关键词]增生性瘢痕；成纤维细胞；青蒿琥酯；miR-21
[中图分类号]R619+.6 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2017）03-0080-04
皮肤增生性瘢痕是病理性瘢痕的主要类型之一，常常给人们带来瘙痒，病痛甚至活动障碍等多种并发症。降低了人类正常的生活质量，特别是形成于面部的瘢痕严重影响美观，给患者带来很大的精神压力。增生性瘢痕主要组织学特点是成纤维细胞的增加，细胞外基质的过度沉积以及胶原纤维紊乱无章的排列。
青蒿琥酯又称青蒿酯，是由菊科植物黄花蒿叶提取的倍半萜烯的一种内过氧化物。长期以来，人们一直用它作为一种治疗疟疾的传统中药。青蒿琥酯及其衍生物被世界卫生组织列为治疗疟疾的首选药物。它能特异性地抑制恶性疟原虫内质网钙腺苷三磷酸酶的活性。除了抗疟活性外，青蒿琥酯及其衍生物在一些自身免疫疾病模型中也表现出潜在的免疫抑制活性，例如：系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎和自身免疫脑脊髓炎。近年来，人们发现一定剂量的青蒿琥酯可以抑制HSFBs的增值，诱导其凋亡。
MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，大小约为20～25个核苷酸。miRNAs可调节细胞生长和组织分化，与生命过程中发育、疾病密切相关。有研究显示，miR-21能促进纤维化的发生，可以通过促进细胞外基质的沉积从而促进纤维化的出现。慕生枝等人指出，下调HSFBs中miR-21的表达可以抑制HSFBs的增值。本研究通过體外培养HSFBs，采用不同浓度的青蒿琥酯进行干预，检测其对HSFBs增值的影响。同时通过抑制HSFBs中miR-21的表达，再一次验证青蒿琥酯对HSFBs的增值影响，探讨青蒿琥酯对HSFBs抑制作用可能的机制，为开发抗瘢痕药剂提供实验依据。
1材料
1.1主要仪器：TS-IOOF倒置显微镜，日本Nikon公司；全自动多功能型酶标仪，美国BIO-RAD公司，实时定量PCR扩增仪，美国ABI公司。
1.2主要试剂：青蒿琥酯，纯度99.99%，桂林南药股份公司；DMEM培养基、胎牛血清，美国Gibico公司；CCK8，美国Sigma公司；鼠抗人波形蛋白、鼠抗人CTGF单克隆抗体、鼠抗人Ⅰ型胶原多克隆抗体、鼠抗人GAPDH单克隆抗体，武汉博士德公司；RNA提取试剂盒，逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒，日本Takara公司；miR-21 mimics，上海吉码生物。
2方法
2.1 HSFBs的原代培养及鉴定：瘢痕标本来源于广州医学院附属第一医院烧伤整形科外科手术切除的增生性瘢痕，取材前经患者知情同意。组织采纳的标准为3年内没有接受抗瘢痕治疗，没有系统性疾病。采用组织块法进行原代培养。20%胎牛血清的DMEM培养基按照1：3反复传代纯化成纤维细胞。原代细胞、传代细胞均通过倒置显微镜进行观察。取3代成纤维细胞，制备细胞爬片，4%多聚甲醛固定，进行波形蛋白免疫组化染色鉴定。
2.2 CCK8检测HSFBs增值：细胞弃去培养液，用PBS洗涤细胞2次，弃去PBS，加入0.25%胰酶，在显微镜下观察，当胞质回缩，细胞之间不再连接成片，加入新鲜的完全培养基，制备细胞悬液；然后调整细胞密度至1×105/μl，取100 μl细胞悬液加入96孔板，即每孔种1×104个细胞，放入培养箱培养，常规培养；分别加入100、200、300、500μmol/L处理HSFBs，对照组加入培养基，继续培养24h。细胞处理结束的前4h，吸去培养液，按每lml完全培养基加入100 μl CCK-8将二者混合均匀后，每孔加入100 μl的CCK-8混合液，避免产生气泡，将培养板放到培养箱内孵育4h，4h后，将96孔板中的液体移至酶标板中，在492nm波长下测定吸光度（A）值。
2.3 qRT-PCR检测miR-21、CTGF及MMP1mRNA的表达：各组经处理后的细胞根据RNA快速提取试剂盒说明书步骤提取细胞总RNA。按照Takara RNA PCR Kit（AMY）Vet.3.0说明书操作进行反转录。用RT试剂盒将RNA反转录为cDNA，然后以cDNA的第1链作为模板进行PCR扩增。PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析、DNA吸光度扫描检测；显色条带图像分析系统（Alpha Imager 2000）检测其积分吸光度值，与内参GAPDH条带的比值为mRNA表达水平参数。miR-21的基因表达检测是以U6小RNA为内参。所用引物均由上海生工有限公司合成。具体引物序列表1。
2.4免疫荧光检测波形蛋白：细胞在盖片上生长融合到95%～100%时，用1×PBS洗3次，每次10min；4%的甲醛室温固定25min；O.2%TritonX-100透化2～5min；5%牛血清白蛋白（BSA）室温封闭30min，加一抗波形蛋白（用1%BSA按照1：1000稀释）4℃过夜，1×PBS洗涤3次，每次10min；加二抗IgG（用1%BSA按照1：1000稀释）暗室避光30min，95%甘油封片。荧光显微镜下观察结果并拍摄图片。 2.5 Western blot检测CTGF和MMP1的表达：每25cm2细胞加入蛋白裂解液200 μl，冰上裂解细胞30min，离心收集总蛋白。常规聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜，5%脱脂奶粉室温下封闭2h，4℃孵育一抗过夜（CTGF1：500稀释，Ⅰ型胶原1：1000稀释），室温下孵育二抗30min（1：5000稀释）；GAPDH作为内参照（1：10000稀释）。暗室内ECL化学发光及显影、定影。
2.6数据分析：所有数据采用SPSS13.0软件处理，计量数据以均数±标准（x±s）表示，统计学分析多样本比较采用单因素方差分析（one-wayANOVA），两两比较采用LSD法，以P<0.05为差异具有统计学意义。
3结果
3.1 HSFBs原代分离及鉴定结果：培养5～7d可见组织块周围有细小呈长梭状贴壁细胞，之后梭形细胞快速增值，20d左右可长满25cm2培养瓶，生长状态如图1A；传至第三代，可以获得较纯的成纤维细胞，所有细胞胞质均呈抗波形蛋白染色阳性（图1B）。
3.2青蒿琥酯对HSFBs的增值及miR-21的表达的影响：100、200、300、500μmol/L的青蒿琥酯处理HSFBs，CCK8结果显示，随着青蒿琥酯浓度的增加，对HSFBs增值的抑制作用增加，且与对照组相比，48h后，300及500μmol/L青蒿琥酯处理组有显著性差异（P<0.05）（图2A）。miR-21的表达也明显下降，且200、300、500μmol/L的青蒿琥酯处理组与对照组相比，有显著性差异（P<0.05）（图2B）。使用300μmol/L的青蒿琥酯进行以下实验。
3.3上调miR-21后，青蒿琥酯对HSFBs增值抑制作用鉴定：用青蒿琥酯处理HSFBs，处理后将细胞分成3组，分别为对照组，mimics NC组和mimics组。分别对三组细胞进行qRT-PCR，wB和CCK8检测。与对照组和mimics NC相比，mimics组miR-21（图3A）和CTGF mRNA（图3B）表达上升，而MMP-1 mRNA（图3C）的表达下降，且均有统计学意义（P<0.05）。与对照组和mimics NC相比，mimics组CTGF的蛋白表达上升，MMP-1蛋白表达下降（图3D）。与对照组和mimics NC相比，mimics组HSFBs增值抑制作用降低，且48h后具有统计学意义（P<0.05）。
4讨论
增生性瘢痕是人体对创伤产生过度愈合反应的结果，是人体烧伤、外伤或者炎症一种过度的皮肤纤维增生性疾病，成纤维细胞增殖旺盛、细胞外基质中的胶原、糖蛋白等过度的沉积，胶原蛋白排列紊乱为主要的病理特征。而人们认为其可能与异物反应、胶原降解、免疫反应异常有关。成纤维细胞在伤口上皮化以后继续旺盛增殖且凋亡过程发生抑制、胶原等细胞外基质合成与降解失衡、部分生长因子的大量产生和持续性存在，这三者密切关联构成了增生性瘢痕形成的生物学基础。增生性瘢痕与正常皮肤的成纤维细胞的形态结构不同，表现为纤维细胞持续旺盛同时大量分泌胶原等细胞外基质，使组织体积不断的增大引起副作用，比如功能型障碍。所以成纤维细胞的生长异常，被认为是瘢痕形成过程中的主要因素。
miRNA是一种长度约为19-22nt的非编码RNA，调节正常生理过程及病理过程，如器官的发育，创伤的愈合以及肿瘤的发生，几乎参与调控细胞活动的各个环节。有报道指出，miR-21参与间质纤维化和心肌肥厚的成纤维细胞中呈现高表达的状态，miRNA-21的表达失调也可能调控肺纤维化的。本研究发现，使用青蒿琥酯可以降低miR-21的表达以及降低HSFBs的增殖。而通过加入miR-21minics可以降低青蒿琥酯的作用。這表明通过青蒿琥酯降低miR-21的表达能够抑制瘢痕的形成。
Ⅰ型胶原的过度合成和降解减少是增生性瘢痕形成的原因之一。抑制成纤维细胞中胶原蛋白的形成可以明显地抑制瘢痕增生。而基质金属蛋白酶（MMPs）可以调控细胞外基质的持续降解。MMP-1能够破坏胶原热稳定性。组织中的MMP-1含量的多少级活性的强弱和细胞外基质的降解程度有关。本研究发现，提高miR-21的含量可以降低青蒿琥酯抑制HSFBs的增殖，而此过程与CTGF的表达升高和MMP-1的表达降低有关。从而推测青蒿琥酯可能一方面通过下降miR-21的表达而影响CTGF的表达，与此同时，通过上调MMP-1的表达，加速胶原的降解。
综上所述，本实验揭示青蒿琥酯可以抑制HSFBs增殖，通过下调miR-21的表达，而通过上调miR-21的含量，可以上调CTGF的表达而降低MMP-1的表达。从而增加细胞外胶原基质的沉积，增大HSFBs的增殖。所以miR-21对瘢痕的发生起着至关重要的作用，这对于临床上应用miR-21靶向分子治疗增生性瘢痕提供了理论基础。