论文部分内容阅读
[摘 要]随着植物基因工程技术的不断发展，转基因植物的研究与应用已取得了骄人成绩，相继培育出了一些抗病、抗虫、抗除草剂和高产优质的转基因农作物新品种。与此同时，转基因植物的筛选检测技术也在不断发展、完善，不但节省筛选时间和成本，而且为科学地评价转基因作物提供技术支持。实验室常用的转基因植物筛选试剂有草铵膦、卡那霉素和潮霉素。
[关键词]转基因，筛选，草丁膦，卡那霉素，潮霉素
中图分类号：TF046.6 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）24-0251-01
1983年世界首例转基因植物培育成功，标志着人类用转基因技术改良农作物的开始。转基因作物于1987年被允许进入田间鉴定试验，1992年开始大田产量试验，1995年完成安全性评价研究，1996年进行商业化生产种植面积为174万hm2，2002年，这一数字增长了33倍。目前，产业化的转基因作物主要包括抗除草剂大豆、抗虫玉米、抗虫棉花和抗除草剂油菜等，其他具有优良性状的转基因作物也呈现良好的产业化前景。
植物转基因因受到受体系统的限制，外源基因的转化得率较低，为了获得有效转化样本，需要进行大量的转化筛选实验获得目的样本，采用何种方法才能解决在大量的待选材料中快速、有效的检测出转基因阳性植物或者细胞;检测外源基因是否已经整合到植物染色体上;是否正确表达等一系列问题？本文仅对常用的转基因植物筛选试剂作以简要的介绍。
草铵膦（Phosphinothricin，PPT），是一种有机磷类除草剂（basta的活性成分），其有效成分是膦丝菌素（PPT）。草铵膦主要通过抑制谷氨酰胺合成酶（GS）活性，使植物体内氮代谢紊乱、细胞内氨的含量过高而中毒、叶绿素解体、光合作用受到抑制，最终导致植物死亡。谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内唯一能降解氨毒的酶，能够去除植物体内因硝酸还原反应、氨基降解反应和光呼吸反应过程所释放的氨。草铵膦乙酰转移酶基因Bar，从土壤吸水链霉菌中分离克隆而来，其编码的草铵膦乙酰转移酶（PAT）对草铵膦专一性高，它可以催化PPT的自由氨基乙酰化，使PPT不能抑制GS的活性，含有该基因的植物具有对Basta的抗性。
利用Basta筛选转基因植物主要有两种方法。一种是在幼苗长出叶片之后直接向待筛选植株喷施Basta，另一种是在MS培养基中加入适当浓度的Basta。培养皿中央点野生型种子作为对照，其余部分点突变体种子，水平放置培养。挑选发芽较好的幼苗，移栽到土壤中作为候选突变体培养。不同的植物对于Basta的敏感程度不同，同一植物不同生长阶段对于Basta的敏感程度也不同。临界筛选浓度的判定标准：以野生型几乎不能发芽或者发芽不能存活的basta浓度。根据拟南芥幼苗的黄化程度和死亡率确定出basta最佳筛选浓度。
卡那霉素（Kanamycin），主要分为盐酸卡那霉素和硫酸卡那霉素两种，其本质是一种蛋白质生物合成抑制剂，主要用于分子克隆中被作为标记基因。卡那霉素属于氨基糖苷类抗生素，能够与叶绿体和线粒体中的核糖体30S亚基结合，从而干扰蛋白质的合成，引起植物绿色器官的黄化，最终导致植物的死亡。常用nptⅡ基因作为遗传标记基因，其编码新霉素磷酸转移酶Ⅱ能使植物产生抗卡那霉素特性，对转化植株进行筛选。卡那霉素属于氨基糖苷类抗生素，能够与叶绿体和线粒体中的核糖体30S亚基结合，从而干扰蛋白质的合成，引起植物绿色器官的黄化，最终导致植物的死亡。
利用卡那霉素筛选转基因植物主要是在MS培养基中加入适当浓度的卡那霉素。根据拟南芥幼苗的死亡率确定出卡那霉素最佳筛选浓度。培养皿中央点野生型种子作为对照，其余部分点突变体种子，水平放置。挑选发芽较好的幼苗，移栽到土壤中作为候选突变体培养。
潮霉素（hygromycin），性状为微黄褐色粉末，毒性较低，具有一定的驱虫活性。潮霉素（Hyg）是一种氨基糖苷类抗生素，通过竞争叶绿体和线粒体中的核糖体与延长因子EF-2的结合位点，破坏细胞中核糖体的功能，从而抑制蛋白的合成，使敏感组织褐化死亡。用于真菌、植物、动物等生物体外源基因转化的筛选。
目前，转基因技术比较完善、成熟，但对目的基因的转化，还比较难做到定量、定位，因此需要对转基因植物进行筛选与检测。本文仅对这三种筛选试剂进行简要概述，后续还会继续深入研究，探究不同检测目的和要求下，转基因植物最适的筛选检测方法，以期得到高效、快速、便捷、安全的检测方法。
参考文献
[1] Yasushi N.， et al.Simultaneous LC-MS/MS analysis of Glyphosate， Glufosinate，and their metabolic products in beer， barley tea， and their ingredients. Biosci. Biotechnol. Biochem， 2013， 77（11）： 2218-2221.
[2] Yul-Kyun Ahn， et al. Development of an Efficient Agrobacterium-Mediated Transformation System and Production of Herbicide-Resistant Transgenic Plants in Garlic.Molecules and Cells， 2013， 36： 158-162.
[3] Ayalew Mentewab， et al.RNA-Seq Analysis of the Effect of Kanamycin and the ABC Transporter AtWBC19 on Arabidopsis thaliana Seedlings Reveals Changes in Metal Content. PLOS ONE， 2014， 9（10）： e109310.
[4] Srinath？Tamirisa， et al.Overexpression of pigeonpea stress-induced cold and drought regulatory gene （CcCDR） confers drought， salt， and cold tolerance in Arabidopsis.Journal of Experimental Botany， 2014， 65（17）： 4769-4781.
[5] Xie Z， Sundstr？m JF， Jin Y， et al. A selection strategy in plant transformation based on antisense oligodeoxynucleotide inhibition. Plant J， 2014， 77（6）： 954-961.
[6] Zhang H， Li J. From Cytosol to the Apoplast： The Hygromycin Phosphotransferase （HYG（R）） Model in Arabidopsis. Methods Mol Biol， 2016， 1459： 81-90.
[关键词]转基因，筛选，草丁膦，卡那霉素，潮霉素
中图分类号：TF046.6 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）24-0251-01
1983年世界首例转基因植物培育成功，标志着人类用转基因技术改良农作物的开始。转基因作物于1987年被允许进入田间鉴定试验，1992年开始大田产量试验，1995年完成安全性评价研究，1996年进行商业化生产种植面积为174万hm2，2002年，这一数字增长了33倍。目前，产业化的转基因作物主要包括抗除草剂大豆、抗虫玉米、抗虫棉花和抗除草剂油菜等，其他具有优良性状的转基因作物也呈现良好的产业化前景。
植物转基因因受到受体系统的限制，外源基因的转化得率较低，为了获得有效转化样本，需要进行大量的转化筛选实验获得目的样本，采用何种方法才能解决在大量的待选材料中快速、有效的检测出转基因阳性植物或者细胞;检测外源基因是否已经整合到植物染色体上;是否正确表达等一系列问题？本文仅对常用的转基因植物筛选试剂作以简要的介绍。
草铵膦（Phosphinothricin，PPT），是一种有机磷类除草剂（basta的活性成分），其有效成分是膦丝菌素（PPT）。草铵膦主要通过抑制谷氨酰胺合成酶（GS）活性，使植物体内氮代谢紊乱、细胞内氨的含量过高而中毒、叶绿素解体、光合作用受到抑制，最终导致植物死亡。谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内唯一能降解氨毒的酶，能够去除植物体内因硝酸还原反应、氨基降解反应和光呼吸反应过程所释放的氨。草铵膦乙酰转移酶基因Bar，从土壤吸水链霉菌中分离克隆而来，其编码的草铵膦乙酰转移酶（PAT）对草铵膦专一性高，它可以催化PPT的自由氨基乙酰化，使PPT不能抑制GS的活性，含有该基因的植物具有对Basta的抗性。
利用Basta筛选转基因植物主要有两种方法。一种是在幼苗长出叶片之后直接向待筛选植株喷施Basta，另一种是在MS培养基中加入适当浓度的Basta。培养皿中央点野生型种子作为对照，其余部分点突变体种子，水平放置培养。挑选发芽较好的幼苗，移栽到土壤中作为候选突变体培养。不同的植物对于Basta的敏感程度不同，同一植物不同生长阶段对于Basta的敏感程度也不同。临界筛选浓度的判定标准：以野生型几乎不能发芽或者发芽不能存活的basta浓度。根据拟南芥幼苗的黄化程度和死亡率确定出basta最佳筛选浓度。
卡那霉素（Kanamycin），主要分为盐酸卡那霉素和硫酸卡那霉素两种，其本质是一种蛋白质生物合成抑制剂，主要用于分子克隆中被作为标记基因。卡那霉素属于氨基糖苷类抗生素，能够与叶绿体和线粒体中的核糖体30S亚基结合，从而干扰蛋白质的合成，引起植物绿色器官的黄化，最终导致植物的死亡。常用nptⅡ基因作为遗传标记基因，其编码新霉素磷酸转移酶Ⅱ能使植物产生抗卡那霉素特性，对转化植株进行筛选。卡那霉素属于氨基糖苷类抗生素，能够与叶绿体和线粒体中的核糖体30S亚基结合，从而干扰蛋白质的合成，引起植物绿色器官的黄化，最终导致植物的死亡。
利用卡那霉素筛选转基因植物主要是在MS培养基中加入适当浓度的卡那霉素。根据拟南芥幼苗的死亡率确定出卡那霉素最佳筛选浓度。培养皿中央点野生型种子作为对照，其余部分点突变体种子，水平放置。挑选发芽较好的幼苗，移栽到土壤中作为候选突变体培养。
潮霉素（hygromycin），性状为微黄褐色粉末，毒性较低，具有一定的驱虫活性。潮霉素（Hyg）是一种氨基糖苷类抗生素，通过竞争叶绿体和线粒体中的核糖体与延长因子EF-2的结合位点，破坏细胞中核糖体的功能，从而抑制蛋白的合成，使敏感组织褐化死亡。用于真菌、植物、动物等生物体外源基因转化的筛选。
目前，转基因技术比较完善、成熟，但对目的基因的转化，还比较难做到定量、定位，因此需要对转基因植物进行筛选与检测。本文仅对这三种筛选试剂进行简要概述，后续还会继续深入研究，探究不同检测目的和要求下，转基因植物最适的筛选检测方法，以期得到高效、快速、便捷、安全的检测方法。
参考文献
[1] Yasushi N.， et al.Simultaneous LC-MS/MS analysis of Glyphosate， Glufosinate，and their metabolic products in beer， barley tea， and their ingredients. Biosci. Biotechnol. Biochem， 2013， 77（11）： 2218-2221.
[2] Yul-Kyun Ahn， et al. Development of an Efficient Agrobacterium-Mediated Transformation System and Production of Herbicide-Resistant Transgenic Plants in Garlic.Molecules and Cells， 2013， 36： 158-162.
[3] Ayalew Mentewab， et al.RNA-Seq Analysis of the Effect of Kanamycin and the ABC Transporter AtWBC19 on Arabidopsis thaliana Seedlings Reveals Changes in Metal Content. PLOS ONE， 2014， 9（10）： e109310.
[4] Srinath？Tamirisa， et al.Overexpression of pigeonpea stress-induced cold and drought regulatory gene （CcCDR） confers drought， salt， and cold tolerance in Arabidopsis.Journal of Experimental Botany， 2014， 65（17）： 4769-4781.
[5] Xie Z， Sundstr？m JF， Jin Y， et al. A selection strategy in plant transformation based on antisense oligodeoxynucleotide inhibition. Plant J， 2014， 77（6）： 954-961.
[6] Zhang H， Li J. From Cytosol to the Apoplast： The Hygromycin Phosphotransferase （HYG（R）） Model in Arabidopsis. Methods Mol Biol， 2016， 1459： 81-90.