【摘 要】
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为克隆柔嫩艾美耳球虫裂殖子阶段的功能基因的全长序列,利用SMART技术,采用Clontech 公司的CreatorTM SMARTTM cDNA Library Construction Kit构建了鸡球虫裂殖子的全长cDNA
【机 构】
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广东省农业科学院兽医研究所,河南农业大学牧医工程学院,华南农业大学兽医学院,广州英赛特生物技术有限公司,吴彩艳
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为克隆柔嫩艾美耳球虫裂殖子阶段的功能基因的全长序列,利用SMART技术,采用Clontech 公司的CreatorTM SMARTTM cDNA Library Construction Kit构建了鸡球虫裂殖子的全长cDNA文库.用试剂盒提取mRNA后,以cDNA合成试剂盒合成cDNA.连接至pDNR-LIB载体,用电转化法将重组质粒转化到E.coli DH10B内得到原始文库,扩增后保存于-80℃冰箱内；最后以文库为模板,分别以研究室已成功克隆序列(EtSAG2、EtMIC-2、EtMCAT)及Sanger的部分EST序列(Contig1218)设计引物,进行PCR扩增并测序检验文库的实用性.经测定,构建的初级cDNA文库约含有8.72×107个重组子,插入的片段多在1 kb～3 kb之间,平均插入片段长度约1.8 kb,扩增后文库保存的滴度为2.4×104 cfu/mL;通过文库的PCR扩增,不仅可以成功扩增出研究室已成功克隆的序列(EtSAG2、EtMIC-2),并成功获得EtMCAT和EST序列(Contig1218)的全长cDNA序列,经比对分析Contig1218所编码的蛋白为组织蛋白酶B样半胱氨酸蛋白酶(Cathepsin B).结果表明,已成功构建了柔嫩艾美耳球虫裂殖子高质量的全长cDNA文库,从而为筛选鸡球虫的功能基因全长序列奠定了基础.
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