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【摘 要】 目的：建立以HPLC-ELSD法测定玄麦甘桔颗粒中桔梗皂苷D含量的方法。方法：以Agilent C18（250mm×4.6 mm，5μm）为色谱柱;以乙腈-水（25∶75）为流动相;流速1.0 mL/min;柱温30 ℃;蒸发光散射检测器检测。结果：桔梗皂苷D在0.4794～5.9915μg（r=0.9994）范围内线性关系良好，回归方程：y=1.7258x-0.4426，平均加样回收为99.0%（RSD=1.0%）。结论： 本研究方法准确可靠、重复性好，可用于该制剂的质量控制和评价。
【关键词】 玄麦甘桔颗粒;桔梗皂苷D;高效液相色谱蒸发光散射法;含量测定
【中图分类号】R286 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2021）14-0031-03
Abstract：Objective To establish a HPLC-ELSD method for the determination of platycodon D in Xuanmaganju granules. Methods Agilent C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm） was used as chromatographic column. Acetonitrile-water （25∶75） was used as mobile phase. The flow rate of 1.0 mL/min; Column temperature 30 ℃. The temperature of the drift tube was 105℃ and the carrier gas was nitrogen （flow rate was 2.5L/min）. Results The linear relationship of platycodon platycodon D was good in the range of 0.4794～5.9915 μg（r=0.9994）. The regression equation was y=1.7258x-0.4426， and the average sample recovery was % （RSD=99.0%）.Conclusion The method is accurate， reliable and reproducible， and can be used for the quality control and evaluation of this preparation.
Keywords：Xuanmaganju Granules;Platycodin D;HPLC-ELSD;Content Determination
玄麥甘桔颗粒是由玄参、麦冬、甘草、桔梗四味药材的水煎液浓缩为稠膏，加入适量的辅料（蔗糖或糊精）制成的颗粒[1]811。处方中四味药材用量均等，玄参清热解毒，麦冬润肺养阴，甘草补脾调和诸药，桔梗能宣肺祛痰，四药合用，有清热解毒、滋阴降火、祛痰利咽的功效。但在质量标准控制上，《中国药典》2015年版通过薄层色谱和高效液相色谱法对其中玄参、甘草进行定性和定量控制，对麦冬和桔梗未进行质量控制。文献报道中，也多对甘草酸、甘草苷、哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸进行研究，而未建立其中桔梗药味的质量控制方法。
桔梗有宣肺、利咽、祛痰、排脓的功效[1]277，赵秀玲[2]指出桔梗在食用和药用上都有较高的价值，其中主要活性成分为皂苷类，具备抗高温、抗水肿、抗毒、抗炎等作用。而桔梗皂苷D是桔梗皂苷中的主要皂苷[4]，本实验通过建立桔梗皂苷D的含量测定方法，为进一步评价玄麦甘桔颗粒的品质提供科学的办法。
1 仪器与试药
1.1 仪器 Waters 2695液相色谱仪及配套工作站，蒸发光散射检测器，色谱柱为Agilent C18柱，4.6 mm×150 mm，流速1.0 mL/min。
1.2 试药 玄麦甘桔颗粒分别来自于云南白药股份有限公司（样1、样2）、葵花药业集团（重庆）有限公司（样3、样4）、太极集团重庆中药二厂有限公司（样5、样6）;桔梗皂苷D来源于中国食品药品检定研究院（批号：111851-201405，含量：93.0%）;乙腈为色谱纯，甲醇、正丁醇、氨水、等试液均为分析纯，水为纯化水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm 5 μm）;流动相：乙腈-水（25∶75）：蒸发光散射检测器检测;柱温30 ℃;流速：1.0mL/min;测定法：分别精密吸取对照品溶液10 μL与供试品溶液10～20 μL，注入液相色谱仪，测定。
2.2 对照品溶液的制备 取桔梗皂苷D对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.25 mg的溶液，即得。
2.3 供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品，混匀，取适量，研细，取约20 g，精密称定，置具塞锥瓶中，精密加入甲醇150 mL，称定重量，超声（功率250 w，频率35 kHz）提取30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液100 mL，置水浴上蒸干，残渣加水20 mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨试液50 mL洗涤，弃去氨液，再用正丁醇饱和的水50 mL洗涤，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
2.4 阴性供试品溶液的制备 取缺桔梗的阴性样品，按照2.3制备成阴性供试品溶液，即得。
2.5 专属性考察 取桔梗皂苷D对照品溶液、玄麦甘桔颗粒供试品溶液及阴性供试品溶液，按照“2.1”色谱条件注入液相色谱仪，供试品溶液色谱在与对照品溶液色谱相应位置有相应的色谱峰，且阴性无干扰，如图1所示。 2.6 线性关系考察 精密吸取桔梗皂苷D对照品溶液（0.2397 μg/mL）2 μL、4 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL依次注入液相色谱仪，测定峰面积。以对照品进样量X（μg）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归计算，得出桔梗皂苷D线性回归方程为：y=1.7258x-0.4426，r=0.9994。桔梗皂苷D在0.4794～5.9915μg的范围内线性关系良好。
2.7 精密度试验 精密量取同一混合对照品10 μL，连续进样6次，记录色谱图峰面积，桔梗皂苷D对照品的峰面积RSD为0.5%，结果说明仪器精密度良好。
2.8 重复性试验 取同一批玄麦甘桔颗粒，按“2.3”供试品溶液制备方法制备6份，按“2.1”色谱条件测定桔梗皂苷D的含量，结果测定桔梗皂苷D平均含量43.3μg/g，RSD為1.8%，表明方法重复性良好。
2.9 稳定性试验 取同一批玄麦甘桔颗粒，按“2.1”色谱条件，于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、18 h，测定桔梗皂苷D的峰面积，RSD为1.7%，表明供试品溶液在18 h内稳定性良好。
2.10 回收率试验 采用加样回收法.取已测定含量的玄麦甘桔颗粒（平均含量43.3 μg/g）10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入含桔梗皂苷D对照品溶液（2.12412 μg/mL）150 mL，称定重量，自“超声处理……”起按“2.3”供试品溶液制备方法制备6份，按“2.1”色谱条件测定桔梗皂苷D的含量，计算回收率。结果表明，该方法准确度良好，见表1。
2.11 样品测定 取三家企业各2批玄麦甘桔颗粒样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”色谱条件测定桔梗皂苷D的含量， 结果见表2。
3 讨论
桔梗皂苷D为2015年版《中国药典》桔梗的含量控制指标，丁大勇等[3]采用75%乙醇对样品进行回流提取，提取液离心，上清液大孔树脂吸附过柱，不同浓度乙醇洗脱。文献[4]也提出了大孔吸附树脂分离桔梗总皂苷的方法。朱丹妮等[5]以甲醇为溶剂，使用超声提取法提取桔梗中的桔梗皂苷D，不进行后续纯化处理。《中国药典》桔梗项下方法最为复杂，使用50%甲醇超声提取后，对提取液进行了萃取、萃取后药液加于硅胶柱上，以三氯甲烷-甲醇不同比例混合溶液分次洗脱[1]277。
参照《中国药典》和相关文献[3-7]，考察实验条件。单纯超声提取，桔梗皂苷D和其他成分无法达到较好的分离效果;超声提取后，使用正丁醇萃取，氨试液洗涤，样品能较好分离;在此基础上分别使用大孔树脂和硅胶柱进行洗脱分离，结果大孔树脂分离的结果含量较低，硅胶柱分离结果含量与未过柱前无明显差异，故选择了更加简单、且无需使用易制毒试剂三氯甲烷的方法。
在供试品溶液制备提取溶剂的选择中，对50%甲醇、80%甲醇、甲醇、乙醇的提取效果进行比较，结果乙醇提取含量较低，而不同浓度的甲醇提取含量值无明显变化，因甲醇处理的样品容易过滤，故选择甲醇方便操作。经方法学考察，表面本法准确可靠、重复性好，灵敏度高，为今后桔梗皂苷D在制剂中的定量分析提供参考。
参考文献
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015：811，277.
[2]赵秀玲.桔梗的化学成分、药理作用及资源开发的研究进展[J].中国调味品，2012，37（2）：5-8.
[3]丁大勇，高菲，姚琳，等. HPLC-ELSD 法测定桑菊感冒片中桔梗皂苷D 的含量[J].中国中医药信息杂志，2012，19（3）：54-55.
[4]杨献文，刘墨祥，刘云刚，等.大孔吸附树脂柱色谱法分离桔梗总皂苷[J].吉林农业大学学报，2001，23（2）：50-52.
[5]朱丹妮，舒娈，郅慧，等.HPLC-ELSD 法测定桔梗中桔梗皂苷D 的含量[J].植物资源与环境学报，2001，10（4）：11-13.
[6]彭善贵，文永盛.高效液相色谱-蒸发光散射检测器法测定甘桔冰梅片中桔梗皂苷D含量[J].药物鉴定，2012，21（19）：28-29.
[7]梁娟，潘见，谢慧明，等.桔梗提取物中桔梗皂苷D的反相高效液相色谱检测方法研究[J].时珍国医国药，2008，19（12）：2911-2912.
（收稿日期：2020-12-12 编辑：刘斌）
【关键词】 玄麦甘桔颗粒;桔梗皂苷D;高效液相色谱蒸发光散射法;含量测定
【中图分类号】R286 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2021）14-0031-03
Abstract：Objective To establish a HPLC-ELSD method for the determination of platycodon D in Xuanmaganju granules. Methods Agilent C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm） was used as chromatographic column. Acetonitrile-water （25∶75） was used as mobile phase. The flow rate of 1.0 mL/min; Column temperature 30 ℃. The temperature of the drift tube was 105℃ and the carrier gas was nitrogen （flow rate was 2.5L/min）. Results The linear relationship of platycodon platycodon D was good in the range of 0.4794～5.9915 μg（r=0.9994）. The regression equation was y=1.7258x-0.4426， and the average sample recovery was % （RSD=99.0%）.Conclusion The method is accurate， reliable and reproducible， and can be used for the quality control and evaluation of this preparation.
Keywords：Xuanmaganju Granules;Platycodin D;HPLC-ELSD;Content Determination
玄麥甘桔颗粒是由玄参、麦冬、甘草、桔梗四味药材的水煎液浓缩为稠膏，加入适量的辅料（蔗糖或糊精）制成的颗粒[1]811。处方中四味药材用量均等，玄参清热解毒，麦冬润肺养阴，甘草补脾调和诸药，桔梗能宣肺祛痰，四药合用，有清热解毒、滋阴降火、祛痰利咽的功效。但在质量标准控制上，《中国药典》2015年版通过薄层色谱和高效液相色谱法对其中玄参、甘草进行定性和定量控制，对麦冬和桔梗未进行质量控制。文献报道中，也多对甘草酸、甘草苷、哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸进行研究，而未建立其中桔梗药味的质量控制方法。
桔梗有宣肺、利咽、祛痰、排脓的功效[1]277，赵秀玲[2]指出桔梗在食用和药用上都有较高的价值，其中主要活性成分为皂苷类，具备抗高温、抗水肿、抗毒、抗炎等作用。而桔梗皂苷D是桔梗皂苷中的主要皂苷[4]，本实验通过建立桔梗皂苷D的含量测定方法，为进一步评价玄麦甘桔颗粒的品质提供科学的办法。
1 仪器与试药
1.1 仪器 Waters 2695液相色谱仪及配套工作站，蒸发光散射检测器，色谱柱为Agilent C18柱，4.6 mm×150 mm，流速1.0 mL/min。
1.2 试药 玄麦甘桔颗粒分别来自于云南白药股份有限公司（样1、样2）、葵花药业集团（重庆）有限公司（样3、样4）、太极集团重庆中药二厂有限公司（样5、样6）;桔梗皂苷D来源于中国食品药品检定研究院（批号：111851-201405，含量：93.0%）;乙腈为色谱纯，甲醇、正丁醇、氨水、等试液均为分析纯，水为纯化水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm 5 μm）;流动相：乙腈-水（25∶75）：蒸发光散射检测器检测;柱温30 ℃;流速：1.0mL/min;测定法：分别精密吸取对照品溶液10 μL与供试品溶液10～20 μL，注入液相色谱仪，测定。
2.2 对照品溶液的制备 取桔梗皂苷D对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.25 mg的溶液，即得。
2.3 供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品，混匀，取适量，研细，取约20 g，精密称定，置具塞锥瓶中，精密加入甲醇150 mL，称定重量，超声（功率250 w，频率35 kHz）提取30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液100 mL，置水浴上蒸干，残渣加水20 mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨试液50 mL洗涤，弃去氨液，再用正丁醇饱和的水50 mL洗涤，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
2.4 阴性供试品溶液的制备 取缺桔梗的阴性样品，按照2.3制备成阴性供试品溶液，即得。
2.5 专属性考察 取桔梗皂苷D对照品溶液、玄麦甘桔颗粒供试品溶液及阴性供试品溶液，按照“2.1”色谱条件注入液相色谱仪，供试品溶液色谱在与对照品溶液色谱相应位置有相应的色谱峰，且阴性无干扰，如图1所示。 2.6 线性关系考察 精密吸取桔梗皂苷D对照品溶液（0.2397 μg/mL）2 μL、4 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL依次注入液相色谱仪，测定峰面积。以对照品进样量X（μg）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归计算，得出桔梗皂苷D线性回归方程为：y=1.7258x-0.4426，r=0.9994。桔梗皂苷D在0.4794～5.9915μg的范围内线性关系良好。
2.7 精密度试验 精密量取同一混合对照品10 μL，连续进样6次，记录色谱图峰面积，桔梗皂苷D对照品的峰面积RSD为0.5%，结果说明仪器精密度良好。
2.8 重复性试验 取同一批玄麦甘桔颗粒，按“2.3”供试品溶液制备方法制备6份，按“2.1”色谱条件测定桔梗皂苷D的含量，结果测定桔梗皂苷D平均含量43.3μg/g，RSD為1.8%，表明方法重复性良好。
2.9 稳定性试验 取同一批玄麦甘桔颗粒，按“2.1”色谱条件，于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、18 h，测定桔梗皂苷D的峰面积，RSD为1.7%，表明供试品溶液在18 h内稳定性良好。
2.10 回收率试验 采用加样回收法.取已测定含量的玄麦甘桔颗粒（平均含量43.3 μg/g）10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入含桔梗皂苷D对照品溶液（2.12412 μg/mL）150 mL，称定重量，自“超声处理……”起按“2.3”供试品溶液制备方法制备6份，按“2.1”色谱条件测定桔梗皂苷D的含量，计算回收率。结果表明，该方法准确度良好，见表1。
2.11 样品测定 取三家企业各2批玄麦甘桔颗粒样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”色谱条件测定桔梗皂苷D的含量， 结果见表2。
3 讨论
桔梗皂苷D为2015年版《中国药典》桔梗的含量控制指标，丁大勇等[3]采用75%乙醇对样品进行回流提取，提取液离心，上清液大孔树脂吸附过柱，不同浓度乙醇洗脱。文献[4]也提出了大孔吸附树脂分离桔梗总皂苷的方法。朱丹妮等[5]以甲醇为溶剂，使用超声提取法提取桔梗中的桔梗皂苷D，不进行后续纯化处理。《中国药典》桔梗项下方法最为复杂，使用50%甲醇超声提取后，对提取液进行了萃取、萃取后药液加于硅胶柱上，以三氯甲烷-甲醇不同比例混合溶液分次洗脱[1]277。
参照《中国药典》和相关文献[3-7]，考察实验条件。单纯超声提取，桔梗皂苷D和其他成分无法达到较好的分离效果;超声提取后，使用正丁醇萃取，氨试液洗涤，样品能较好分离;在此基础上分别使用大孔树脂和硅胶柱进行洗脱分离，结果大孔树脂分离的结果含量较低，硅胶柱分离结果含量与未过柱前无明显差异，故选择了更加简单、且无需使用易制毒试剂三氯甲烷的方法。
在供试品溶液制备提取溶剂的选择中，对50%甲醇、80%甲醇、甲醇、乙醇的提取效果进行比较，结果乙醇提取含量较低，而不同浓度的甲醇提取含量值无明显变化，因甲醇处理的样品容易过滤，故选择甲醇方便操作。经方法学考察，表面本法准确可靠、重复性好，灵敏度高，为今后桔梗皂苷D在制剂中的定量分析提供参考。
参考文献
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015：811，277.
[2]赵秀玲.桔梗的化学成分、药理作用及资源开发的研究进展[J].中国调味品，2012，37（2）：5-8.
[3]丁大勇，高菲，姚琳，等. HPLC-ELSD 法测定桑菊感冒片中桔梗皂苷D 的含量[J].中国中医药信息杂志，2012，19（3）：54-55.
[4]杨献文，刘墨祥，刘云刚，等.大孔吸附树脂柱色谱法分离桔梗总皂苷[J].吉林农业大学学报，2001，23（2）：50-52.
[5]朱丹妮，舒娈，郅慧，等.HPLC-ELSD 法测定桔梗中桔梗皂苷D 的含量[J].植物资源与环境学报，2001，10（4）：11-13.
[6]彭善贵，文永盛.高效液相色谱-蒸发光散射检测器法测定甘桔冰梅片中桔梗皂苷D含量[J].药物鉴定，2012，21（19）：28-29.
[7]梁娟，潘见，谢慧明，等.桔梗提取物中桔梗皂苷D的反相高效液相色谱检测方法研究[J].时珍国医国药，2008，19（12）：2911-2912.
（收稿日期：2020-12-12 编辑：刘斌）