论文部分内容阅读
摘要：目的：探究荧光定量PCR法检测乙型肝炎病毒的意义及其原理。
方法：对临床1025份血清标本用荧光定量聚合酶链反应的方法进行HBV DNA定量测试，然后进行研究。
结果：HBsAg（+）、HBeAg（+）、HBcAb（+）模式HBV DNA阳性率为99.2%（390/393），其平均拷贝数为4.65×108拷贝/ml；在HBsAg（+）、HBeAb（+）、HBcAb（+）模式中HBV DNA阳性率为62.5%（261/417）；而68例HBsAg（+）、HBcAb（+）模式中，26例（占38.2%）检出HBV DNA。
结论：荧光定量PCR法是检测乙型肝炎的常用方法，该方法有较高的灵敏性，较高的准确性可以对是否感染乙型肝炎做出比较精准的判断。
关键词：荧光定量PCR法 乙型肝炎 聚合酶链反应
Doi：10.3969/j.issn.1671-8801.2014.06.596
【中图分类号】R9 【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801（2014）06-0368-01
乙型肝炎又叫乙肝，以肝脏炎性病变为主，并会引起众多器官损害。是一种病毒性疾病，如今已广泛流行于世界各国，也是我国现在较为流行，发病广泛，危害性强的一种疾病[1]。现在最为广泛测试方法就是PCR法。所谓的PCR法其实是一种分子生物学方法，PCR法的全名为聚合酶链反应。笔者通过对临床的1025份血清标本进行荧光定量聚合酶链反应探讨荧光定量PCR法的意义及其原理，为甲肝患者的治疗进行指导。
1 材料与方法
1.1 研究对象。选择2013年1月至2013年10月来本院疑似乙肝患者及确诊的乙肝患者共1025人其中男565人，女460人。年龄15至70不等，平均年龄33岁。
1.2 处理标本。取1025位患者和疑似患者静脉血2ml，放置在4摄氏度的冰箱内冷藏2小时，分离血清，从血清中提取HVB-DNA。
1.3 仪器。自动荧光PCR仪为美国stratagene Mx3000p，酶标仪为美国宝特的ELX-800。
1.4 试剂。HBV-DNA荧光定量试剂盒操作及原理见文献[2]。
2 结果
准确的测出乙型肝炎病毒的数量，并且比以前的方法在时间上大大的缩短。
3 讨论
DNA的天然复制有些相似，它的特异性依赖于存在与靶序列两端互补的寡核苷酸引物其步骤为先将模板DNA变性也就是第一步变性，加热使模板DNA至93摄氏度，加热后形成DNA单链，可以便于与引物结合。第二步将DNA退火，当模板DNA经过加热变成DNA单链后使其温度降低到55摄氏度左右，让引物和模板DNA单链结合。第三步延伸，将结合好的结合物在酶的作用下，产生新链一般进行三十次的循环，在一开始的循环阶段，原来的DNA链会充当模板桥梁的角色，随着循环次数的增多引物延伸链的急剧增多而变成主要的模板，如此循环之后在二至三小时之后基因就会放大几百万倍。[3]
PCR在复性和延伸温度上有着其特殊的要求复性的温度是PCR扩增能否顺利进行的关键，一般在50摄氏度到60摄氏度之间。具体的温度主要是由引物的tm值决定的。延伸温度大多数设定在72摄氏度，如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一个温度。基于PCR三步骤的原理，大致可以将PCR的温度化为三段，先设置90至95摄氏度这是双链DNA变性，然后迅速的讲温度设置到40至60摄氏度再快速升温到70至75度，完成后两步。反应时间变性一般在30秒就可以了，如果模板=DNAG+C含量较高，或者直接用细胞做模板，这样变性的时间就可以根据情况而增长。而复性的时间一般来说30秒就足够了。同时PCR在循环次数上也跟模板DNA有着密切关系，通常为25倒35次。
HVB-DNA定量检测方法的出现从本质上改变了只是单一的免疫学方法间接检测的局限性，不仅可以判断疾病的严重程度和传染性，而且HVB-DNA是直接反应HBV复制状态以及传染性的最佳指标。通过PCR定量结果与血清免疫学的结果进行综合评价，并用荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒的DNA，将二者进行结合，这样一来对已经感染乙肝的病人的今后的治疗就会更佳的科学。已知HbsAg在血清中被檢验出来的时候一般在乙肝病毒感染后的2到4月出现，平均为56天左右。而HBV-DNA的检出可以将通常人们说的“窗口期“提前六到十五天，这对乙肝病人在早期被诊断和治疗有着重要的意义。一般来说HBV-DNA持续阳性超过六个月就会转变成慢性肝炎。通过这一技术，往往几个星期的乙肝检测，用PCR区区几个小时就可以完成了。
因为PCR法的灵敏度高可以对HBV-DNA检测治疗前进行病毒量的检测，这样可以更准确的选择相应的药品，避免盲目择药。同样PCR检测法可以在HBV-DNA检测治疗后准确的测出病毒数量，有利于判断病情，对下一步治疗做出一个合理的参考。这样来看荧光定量PCR法HBV-DNA在乙肝的治疗中起着非常重要的作用，当荧光定量PCR法HBV-DNA测出的指标降低时这对乙肝治疗的实施有着至关重要的意义，这种状态是乙肝转阴前的征兆，是康复前非常关键的一步[4]，只有当体内HBV-DNA定量指标降低了，病毒的克隆繁殖才会有所停止并得以终止，只有这样乙肝才可以得以控制，乙肝的根治才会看到希望。实时的荧光定量PCR的出现，极大的减少了定量检测的过程中的不必要因素，而且实现了真正的绝对定量。随着生物芯片技术和荧光技术的不断更新换代，荧光定量PCR在医学检测领域的前景会更加开拓。荧光定量PCR技术还可以不断的提高，这就需要我们科技人员不断进取，不断发展的科学技术鞭策着我们前进。
参考文献
[1] 《乙型病毒性肝炎》人民军医出版社
[2] 《中华医学检验杂志》荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒1999年22期
[3] 《实时量PCR检测lgh基因重排的研究》昆明医学院，2004年
[4] 《湖南省乙肝病毒基因型分布及临床意义》刘映霞，胡国龄湖南医科大学学报，2002年01期
方法：对临床1025份血清标本用荧光定量聚合酶链反应的方法进行HBV DNA定量测试，然后进行研究。
结果：HBsAg（+）、HBeAg（+）、HBcAb（+）模式HBV DNA阳性率为99.2%（390/393），其平均拷贝数为4.65×108拷贝/ml；在HBsAg（+）、HBeAb（+）、HBcAb（+）模式中HBV DNA阳性率为62.5%（261/417）；而68例HBsAg（+）、HBcAb（+）模式中，26例（占38.2%）检出HBV DNA。
结论：荧光定量PCR法是检测乙型肝炎的常用方法，该方法有较高的灵敏性，较高的准确性可以对是否感染乙型肝炎做出比较精准的判断。
关键词：荧光定量PCR法 乙型肝炎 聚合酶链反应
Doi：10.3969/j.issn.1671-8801.2014.06.596
【中图分类号】R9 【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801（2014）06-0368-01
乙型肝炎又叫乙肝，以肝脏炎性病变为主，并会引起众多器官损害。是一种病毒性疾病，如今已广泛流行于世界各国，也是我国现在较为流行，发病广泛，危害性强的一种疾病[1]。现在最为广泛测试方法就是PCR法。所谓的PCR法其实是一种分子生物学方法，PCR法的全名为聚合酶链反应。笔者通过对临床的1025份血清标本进行荧光定量聚合酶链反应探讨荧光定量PCR法的意义及其原理，为甲肝患者的治疗进行指导。
1 材料与方法
1.1 研究对象。选择2013年1月至2013年10月来本院疑似乙肝患者及确诊的乙肝患者共1025人其中男565人，女460人。年龄15至70不等，平均年龄33岁。
1.2 处理标本。取1025位患者和疑似患者静脉血2ml，放置在4摄氏度的冰箱内冷藏2小时，分离血清，从血清中提取HVB-DNA。
1.3 仪器。自动荧光PCR仪为美国stratagene Mx3000p，酶标仪为美国宝特的ELX-800。
1.4 试剂。HBV-DNA荧光定量试剂盒操作及原理见文献[2]。
2 结果
准确的测出乙型肝炎病毒的数量，并且比以前的方法在时间上大大的缩短。
3 讨论
DNA的天然复制有些相似，它的特异性依赖于存在与靶序列两端互补的寡核苷酸引物其步骤为先将模板DNA变性也就是第一步变性，加热使模板DNA至93摄氏度，加热后形成DNA单链，可以便于与引物结合。第二步将DNA退火，当模板DNA经过加热变成DNA单链后使其温度降低到55摄氏度左右，让引物和模板DNA单链结合。第三步延伸，将结合好的结合物在酶的作用下，产生新链一般进行三十次的循环，在一开始的循环阶段，原来的DNA链会充当模板桥梁的角色，随着循环次数的增多引物延伸链的急剧增多而变成主要的模板，如此循环之后在二至三小时之后基因就会放大几百万倍。[3]
PCR在复性和延伸温度上有着其特殊的要求复性的温度是PCR扩增能否顺利进行的关键，一般在50摄氏度到60摄氏度之间。具体的温度主要是由引物的tm值决定的。延伸温度大多数设定在72摄氏度，如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一个温度。基于PCR三步骤的原理，大致可以将PCR的温度化为三段，先设置90至95摄氏度这是双链DNA变性，然后迅速的讲温度设置到40至60摄氏度再快速升温到70至75度，完成后两步。反应时间变性一般在30秒就可以了，如果模板=DNAG+C含量较高，或者直接用细胞做模板，这样变性的时间就可以根据情况而增长。而复性的时间一般来说30秒就足够了。同时PCR在循环次数上也跟模板DNA有着密切关系，通常为25倒35次。
HVB-DNA定量检测方法的出现从本质上改变了只是单一的免疫学方法间接检测的局限性，不仅可以判断疾病的严重程度和传染性，而且HVB-DNA是直接反应HBV复制状态以及传染性的最佳指标。通过PCR定量结果与血清免疫学的结果进行综合评价，并用荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒的DNA，将二者进行结合，这样一来对已经感染乙肝的病人的今后的治疗就会更佳的科学。已知HbsAg在血清中被檢验出来的时候一般在乙肝病毒感染后的2到4月出现，平均为56天左右。而HBV-DNA的检出可以将通常人们说的“窗口期“提前六到十五天，这对乙肝病人在早期被诊断和治疗有着重要的意义。一般来说HBV-DNA持续阳性超过六个月就会转变成慢性肝炎。通过这一技术，往往几个星期的乙肝检测，用PCR区区几个小时就可以完成了。
因为PCR法的灵敏度高可以对HBV-DNA检测治疗前进行病毒量的检测，这样可以更准确的选择相应的药品，避免盲目择药。同样PCR检测法可以在HBV-DNA检测治疗后准确的测出病毒数量，有利于判断病情，对下一步治疗做出一个合理的参考。这样来看荧光定量PCR法HBV-DNA在乙肝的治疗中起着非常重要的作用，当荧光定量PCR法HBV-DNA测出的指标降低时这对乙肝治疗的实施有着至关重要的意义，这种状态是乙肝转阴前的征兆，是康复前非常关键的一步[4]，只有当体内HBV-DNA定量指标降低了，病毒的克隆繁殖才会有所停止并得以终止，只有这样乙肝才可以得以控制，乙肝的根治才会看到希望。实时的荧光定量PCR的出现，极大的减少了定量检测的过程中的不必要因素，而且实现了真正的绝对定量。随着生物芯片技术和荧光技术的不断更新换代，荧光定量PCR在医学检测领域的前景会更加开拓。荧光定量PCR技术还可以不断的提高，这就需要我们科技人员不断进取，不断发展的科学技术鞭策着我们前进。
参考文献
[1] 《乙型病毒性肝炎》人民军医出版社
[2] 《中华医学检验杂志》荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒1999年22期
[3] 《实时量PCR检测lgh基因重排的研究》昆明医学院，2004年
[4] 《湖南省乙肝病毒基因型分布及临床意义》刘映霞，胡国龄湖南医科大学学报，2002年01期