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摘 要：目的 分析制药废水中活的但非可培养状态细菌的组成。方法 以采集的制药废水为研究对象，经处理后，利用MPN法分离VBNC状态细菌，并利用Rpf诱导，分析VBNC状态细菌的组成。结果 制药废水中，存在具有优势的、敏感于Rpf的VBNC菌群，其组成包含革兰式阳性放线菌、革兰氏阴性菌等。结论 VBNC状态细菌存在于制药废水中，为深度处理制药废水方法的研制提供参考。
关键词：生物反应器 制药废水 活的但非可培养状态细菌
中图分类号：G8 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2017）04（a）-0245-02
近年来，人们不断提升药品需求，促使制药行业快速的发展，由此也增加了制药废水的排放量。在制药废水中，盐、难溶化合物、有机物、无机物等均包含其中，且具有比较高的化学需氧量，处理时，无论是化学法或是物理法，都难以有效处理，因此，制药废水处理研究中，热点问题即为微生物处理技术的开发[1]。该文以微生物学为切入点，分析制药废水中VBNC状态细菌的组成，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
制药废水：采集于制药公司，尚未进行处理，置入生物反应器中，分别进行30 d、61 d、183 d及361 d的连续流运行，在生物反应器最初出水段的三点分别进行取样，折算为干重后，共3 g，于100 mL锥形瓶中放置，将蒸馏水27 mL加入其中，进行20 min的搅拌，保证充分混匀，制成悬液待用。
试验菌种：藤黄微球菌，来源于分子细胞生物学研究所，制备菌种DNA，按照规定方法进行，将其Rpf基因确定，同时，保证其表达于大肠杆菌中。
主要仪器及试剂：PCR反应扩增仪、凝胶成像系统、UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒等。
1.2 方法
1.2.1 制备培养基
反硝化细菌培养基选择为MPN培养系液体培养基，高压灭菌15 min；由PYM培养基作为MPN培养系分离纯化培养基，高压灭菌15 min。
1.2.2 MPN法和MPN培养系
样品中，可培养细菌总数的统计利用MPN法、MPN培养系进行。培养容器选择为透明玻璃瓶，容量2.5～5.0 mL，于液体培养基中加入10%制备液（其中含有Rpf），作为实验组，于另外液体培养基中加入10%制备液（不含Rpf），作为对照组，稀释10%的样品悬液，浓度梯度为10倍，直至10～6停止，实验组与对照组均分别进行3次，静置培养时温度维持在30℃。以生物反应器运行时间为依据，将两组吸光值的变化（OD660）测量出来，同时，结合肉眼判断，将两组培育液混浊情况准确记录，有混浊为阳性，否则为阴性。根据MPN值，查出两组细菌总数。
1.2.3 判断Rpf阈值、VBNC状态菌
Rpf阈值为实验组细菌总数与对照组细菌总数的比值。Rpf阈值在5以上时，实验组最前方培养液经稀释后表现为混浊，为阳性，对照组为阴性，稀释平板分离实验组培养液后，可得到单位样品中总数属于优势的VBNC状态菌；Rpf阈值为5～1时，稀释平板分离两组最前方混浊培养液，对细菌落形态特征存在的差异做出判断，特征性菌落为实验组特有时，表明VBNC状态细菌敏感于Rpf。
1.2.4 分离菌株
依照相应的试剂盒说明书进行VBNC状态细菌DNA的提取，并进行PCR扩增，分析分离出来的菌株。
2 结果
2.1 MPN值与样品细菌总数
生物反应器运行时间不同时，实验组和对照组的MPN值、细菌总数见表1。经计算可知，运行30 d时，VBNC状态菌复活率为94.1%；运行61 d时，VBNC状态菌复活率97.9%；运行183 d时，VBNC状态菌复活率为55.1%；运行361 d时，VBNC状态菌复活率为48.0%（VBNC状态菌复活率=（实验组细菌总数-对照组细菌总数）/实验组细菌总数×100%）。见表1。
2.2 Rpf阈值、OD660值
由Rpf阈值可知，处于优势的、敏感于Rfp的VBNC状态菌存在于单位样品中。由OD660值可知，实验组均高于对照组，Rpf具有刺激细菌生长的作用。
2.3 菌株分离结果
实验组经培养分离后，在分离中，发现包含丰富的菌株类型，主要為革兰式阳性放线菌、革兰氏阴性菌。
3 讨论
在制药行业生产过程中，会产生大量的制药废水，属于有机废水，浓度比较高，降解难度大。现阶段，主要包含6种制药废水，分别为化学合成类、发酵类、提取类、传统中药类、混装制剂类、生物工程类，其中，占据比重比较大的为化学合成类和发酵类，这两类的污染程度也比较高[2]。基于制药废水的特殊特点，行业研究的热点问题之一即为开发出高效的微生物处理技术，以能有效地处理制药废水。
该研究中，实验组细菌培养时加入了含有Rpf的制备液，对照组加入的制备液中则不含有Rpf，结果显示，实验组的细菌总数多于对照组，而且OD660值也高于对照组，这说明，Rpf蛋白能够刺激部分细菌菌种的生长。此外，经分离实验组VBNC状态细菌后，得到的菌株类型包含革兰式阳性放线菌、革兰氏阴性菌等，均属于近缘菌。实际上，采用普通方法培养细菌时，这些细菌并无法获取，不过利用Rpf蛋白诱导后，改变了细菌的VBNC状态，变为可培养状态，从而被分离出来，这表示，Rpf蛋白能够复苏、刺激革兰氏阳性菌及阴性菌生长的作用。
综上所述，制药废水在生物反应器作用下，经Rpf蛋白的诱导，能够分离出处于VBNC状态的细菌，并能刺激其复活、生长，有利于深入的认识其中VBNC状态细菌的组成，为微生物处理技术的开发提供参考。
参考文献
[1] 康得军，谢丹瑜，唐虹，等.微生物胞外聚合物在水环境中的应用研究[J].工业水处理，2016，13（9）：11-15.
[2] 高学宇.Rpf对印染废水中VBNC菌复苏活化的研究[J].环境科学导刊，2016，21（S1）：110-117.
关键词：生物反应器 制药废水 活的但非可培养状态细菌
中图分类号：G8 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2017）04（a）-0245-02
近年来，人们不断提升药品需求，促使制药行业快速的发展，由此也增加了制药废水的排放量。在制药废水中，盐、难溶化合物、有机物、无机物等均包含其中，且具有比较高的化学需氧量，处理时，无论是化学法或是物理法，都难以有效处理，因此，制药废水处理研究中，热点问题即为微生物处理技术的开发[1]。该文以微生物学为切入点，分析制药废水中VBNC状态细菌的组成，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
制药废水：采集于制药公司，尚未进行处理，置入生物反应器中，分别进行30 d、61 d、183 d及361 d的连续流运行，在生物反应器最初出水段的三点分别进行取样，折算为干重后，共3 g，于100 mL锥形瓶中放置，将蒸馏水27 mL加入其中，进行20 min的搅拌，保证充分混匀，制成悬液待用。
试验菌种：藤黄微球菌，来源于分子细胞生物学研究所，制备菌种DNA，按照规定方法进行，将其Rpf基因确定，同时，保证其表达于大肠杆菌中。
主要仪器及试剂：PCR反应扩增仪、凝胶成像系统、UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒等。
1.2 方法
1.2.1 制备培养基
反硝化细菌培养基选择为MPN培养系液体培养基，高压灭菌15 min；由PYM培养基作为MPN培养系分离纯化培养基，高压灭菌15 min。
1.2.2 MPN法和MPN培养系
样品中，可培养细菌总数的统计利用MPN法、MPN培养系进行。培养容器选择为透明玻璃瓶，容量2.5～5.0 mL，于液体培养基中加入10%制备液（其中含有Rpf），作为实验组，于另外液体培养基中加入10%制备液（不含Rpf），作为对照组，稀释10%的样品悬液，浓度梯度为10倍，直至10～6停止，实验组与对照组均分别进行3次，静置培养时温度维持在30℃。以生物反应器运行时间为依据，将两组吸光值的变化（OD660）测量出来，同时，结合肉眼判断，将两组培育液混浊情况准确记录，有混浊为阳性，否则为阴性。根据MPN值，查出两组细菌总数。
1.2.3 判断Rpf阈值、VBNC状态菌
Rpf阈值为实验组细菌总数与对照组细菌总数的比值。Rpf阈值在5以上时，实验组最前方培养液经稀释后表现为混浊，为阳性，对照组为阴性，稀释平板分离实验组培养液后，可得到单位样品中总数属于优势的VBNC状态菌；Rpf阈值为5～1时，稀释平板分离两组最前方混浊培养液，对细菌落形态特征存在的差异做出判断，特征性菌落为实验组特有时，表明VBNC状态细菌敏感于Rpf。
1.2.4 分离菌株
依照相应的试剂盒说明书进行VBNC状态细菌DNA的提取，并进行PCR扩增，分析分离出来的菌株。
2 结果
2.1 MPN值与样品细菌总数
生物反应器运行时间不同时，实验组和对照组的MPN值、细菌总数见表1。经计算可知，运行30 d时，VBNC状态菌复活率为94.1%；运行61 d时，VBNC状态菌复活率97.9%；运行183 d时，VBNC状态菌复活率为55.1%；运行361 d时，VBNC状态菌复活率为48.0%（VBNC状态菌复活率=（实验组细菌总数-对照组细菌总数）/实验组细菌总数×100%）。见表1。
2.2 Rpf阈值、OD660值
由Rpf阈值可知，处于优势的、敏感于Rfp的VBNC状态菌存在于单位样品中。由OD660值可知，实验组均高于对照组，Rpf具有刺激细菌生长的作用。
2.3 菌株分离结果
实验组经培养分离后，在分离中，发现包含丰富的菌株类型，主要為革兰式阳性放线菌、革兰氏阴性菌。
3 讨论
在制药行业生产过程中，会产生大量的制药废水，属于有机废水，浓度比较高，降解难度大。现阶段，主要包含6种制药废水，分别为化学合成类、发酵类、提取类、传统中药类、混装制剂类、生物工程类，其中，占据比重比较大的为化学合成类和发酵类，这两类的污染程度也比较高[2]。基于制药废水的特殊特点，行业研究的热点问题之一即为开发出高效的微生物处理技术，以能有效地处理制药废水。
该研究中，实验组细菌培养时加入了含有Rpf的制备液，对照组加入的制备液中则不含有Rpf，结果显示，实验组的细菌总数多于对照组，而且OD660值也高于对照组，这说明，Rpf蛋白能够刺激部分细菌菌种的生长。此外，经分离实验组VBNC状态细菌后，得到的菌株类型包含革兰式阳性放线菌、革兰氏阴性菌等，均属于近缘菌。实际上，采用普通方法培养细菌时，这些细菌并无法获取，不过利用Rpf蛋白诱导后，改变了细菌的VBNC状态，变为可培养状态，从而被分离出来，这表示，Rpf蛋白能够复苏、刺激革兰氏阳性菌及阴性菌生长的作用。
综上所述，制药废水在生物反应器作用下，经Rpf蛋白的诱导，能够分离出处于VBNC状态的细菌，并能刺激其复活、生长，有利于深入的认识其中VBNC状态细菌的组成，为微生物处理技术的开发提供参考。
参考文献
[1] 康得军，谢丹瑜，唐虹，等.微生物胞外聚合物在水环境中的应用研究[J].工业水处理，2016，13（9）：11-15.
[2] 高学宇.Rpf对印染废水中VBNC菌复苏活化的研究[J].环境科学导刊，2016，21（S1）：110-117.