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摘要：通过对比Trizol、EASYspin和Qiagen 3种试剂盒提取方法，探讨适合核桃叶片总RNA提取的有效方法。结果表明EASYspin试剂盒提取的RNA纯度较高、完整性好，试验用时较短，且试剂盒成本较低。
关键词：核桃；总RNA；Trizol；EASYspin；Qiagen
中图分类号：Q522文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）02-0011-03
核桃（Juglans regia L.）是我国重要的干果树种，栽培历史悠久，分布广泛。目前，我国核桃的栽培面积和产量均居世界第一位[1]。RNA提取是分子生物学研究的基础，也是试验成败的关键。关于植物RNA提取的方法很多，但由于不同植物材料细胞中次生代谢产物的种类、含量不同，适合的提取方法也不相同。核桃组织中富含多糖多酚等物质。酚类化合物在匀浆时极易被氧化成醌类物质， 与RNA 产生不可逆的结合， 从而影响RNA 的分离纯化[2]。多糖的许多理化性质与RNA 相似，在提取过程中易与RNA 形成共沉淀[3]，且后期很难将其分离开，对RNA的分离和纯化造成很大的干扰。若RNA提取方法不当，会导致RNA埋在多糖形成的粘稠胶状物中难于溶解、分离，严重影响后续试验的稳定性。随着核桃研究的不断深入，对核桃总RNA质量的要求也越来越高，因此，有必要筛选理想的提取方法。
本研究用Trizol、EASYspin和Qiagen 3种试剂盒提取核桃叶片总RNA，通过对RNA纯度和完整性的比较，筛选最适合核桃叶片总RNA提取的方法，为今后核桃的分子生物学试验奠定基础。
1材料与方法
1.1试验材料
本试验所用材料采自国家果树种质泰安核桃板栗资源圃，随机从树的不同方位挑取生长发育正常的幼叶，立即液氮速冻，于-70℃超低温冰箱中保存备用。
1.2试剂与耗材
Trizol、EASYspin RN09与Qiagen 3种试剂盒分别购自北京全式金生物技术有限公司、北京艾德莱（Aidlab）生物科技有限公司和德国凯杰公司。试验所用器皿用0.1% DEPC水处理24 h以上，然后高温灭菌；研钵、玻璃器皿等在180℃高温烘烤12 h以上，备用。
1.3试验方法
提取方法均按相应试剂盒说明书进行。RNA溶解后，分别取2 μl样品，1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统下观察RNA条带的完整性，并拍照记录；另分别取1 μl样品，用紫外分光光度计测定230、260、280 nm下的OD值，并计算OD260/OD280、OD260/OD230值及RNA产率。
2结果与分析
2.13种方法提取总RNA的完整性比较
Trizol试剂盒法提取核桃叶片未能得到肉眼可见的白色RNA沉淀，EASYspin试剂盒与Qiagen试剂盒均为离心柱型试剂盒，提取过程中无法判断沉淀量。经琼脂糖凝胶电泳检测，结果（图1）显示，Trizol试剂盒法没有获得RNA，只有少量降解物；EASYspin试剂盒法和Qiagen试剂盒法提取的核桃叶片总RNA均可见28S、18S和5S RNA谱带，其条带清晰、明亮、完整、无拖尾现象，说明提取的RNA浓度较高、获得量较大且完整无降解。EASYspin试剂盒法点样孔处比较干净，说明提取过程中DNA和蛋白质等污染很少；Qiagen试剂盒法点样孔处有少量残留，表明有微量DNA或蛋白质等杂质的污染。综合比较可知，EASYspin试剂盒法提取的RNA质量较高，效果较好。
3结论与讨论
核桃叶片中富含多糖多酚等物质，酚类化合物被氧化后会与RNA不可逆的结合，导致RNA活性丧失或形成不溶性复合物；多糖会形成难溶的胶状物，与RNA共沉淀[4～6]。因此，必须选择去除多糖多酚的方法进行核桃RNA的提取。EASYspin试剂盒中的RNA助提剂PLANTaid能够帮助结合多糖多酚，并通过离心去除，提高清除效果。本试验结果显示，Trizol试剂盒法未能提取到RNA，EASYspin与Qiagen试剂盒法提取过程基本相似，方便快捷，提取RNA的质量与产率相当，且用时较短，整个过程不到1 h，与CTAB等方法[7～10]相比大大缩短了试验时间。此外，与进口的Qiagen试剂盒相比，国产的EASYspin试剂盒价格低廉很多。
因此，EASYspin试剂盒法最适合核桃叶片总RNA的提取，该法获得的RNA完整性好，无降解，纯度和产率较高，试验耗时少，且试剂盒成本较低。本试验结果为核桃cDNA文库的构建、RT-PCR及其他分子生物学研究奠定了良好的基础，也为其他植物材料的RNA提取提供参考。
参考文献：
[1]郗荣庭， 张毅萍. 中国果树志核桃卷[M].北京：中国林业出版社， 1996.
[2]Loomis W D. Overcoming problems of phenolics and quinines in the isolation of plant enzymes and organelles[J]. Meth. Enzymol.， 1974， 31： 528-544.
[3]Logemann J， Schell J， Willmitzer L. Improved method for the isolation of RNA from plant tissues[J]. Anal. Biochem.， 1987， 163（1）： 16-20.
[4]Schneiderbauer A， Sandermann H Jr， Ernst D. Isolation of functional RNA from plant tissues rich in phenolic compounds[J]. Anal. Biochem.， 1991， 197（1）： 91-95.
[5]Graham G C. A method for extraction of total RNA from Pinus radiata and other conifers[J]. Plant Mol. Biol. Repor.， 1993， 11（1）： 32-37.
[6]Lewinsohn E， Steele C L， Croteau R. Simple isolation of functional RNA from woody stems of gymnosperms [J]. Plant Mol. Biol. Repor.， 1994， 12（1）： 20-25.
[7]Zeng Y， Yang T. RNA isolation from highly viscous samples rich in polyphenols and polysaccharides [J]. Plant Mol. Biol. Repor.， 2002， 20（4）：417.
[8]刘晓菊，洪海波，李敏，等. 改良CTAB法提取核桃总RNA试验[J]. 山东农业科学，2008， 1：97-99.
[9]李晓颖，曹雪，房经贵，等. 杏叶片与果实总RNA提取方法研究[J]. 中国农学通报，2010， 26（2）：152-156.
[10]Tinney G W， Pritchard S C， Gonzalez R， et al. Elimination of oxalate contamination in RNA isolation from Rumex obtusifolius[J]. Plant Mol. Biol. Repor.， 2002， 20（3）：309.
关键词：核桃；总RNA；Trizol；EASYspin；Qiagen
中图分类号：Q522文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）02-0011-03
核桃（Juglans regia L.）是我国重要的干果树种，栽培历史悠久，分布广泛。目前，我国核桃的栽培面积和产量均居世界第一位[1]。RNA提取是分子生物学研究的基础，也是试验成败的关键。关于植物RNA提取的方法很多，但由于不同植物材料细胞中次生代谢产物的种类、含量不同，适合的提取方法也不相同。核桃组织中富含多糖多酚等物质。酚类化合物在匀浆时极易被氧化成醌类物质， 与RNA 产生不可逆的结合， 从而影响RNA 的分离纯化[2]。多糖的许多理化性质与RNA 相似，在提取过程中易与RNA 形成共沉淀[3]，且后期很难将其分离开，对RNA的分离和纯化造成很大的干扰。若RNA提取方法不当，会导致RNA埋在多糖形成的粘稠胶状物中难于溶解、分离，严重影响后续试验的稳定性。随着核桃研究的不断深入，对核桃总RNA质量的要求也越来越高，因此，有必要筛选理想的提取方法。
本研究用Trizol、EASYspin和Qiagen 3种试剂盒提取核桃叶片总RNA，通过对RNA纯度和完整性的比较，筛选最适合核桃叶片总RNA提取的方法，为今后核桃的分子生物学试验奠定基础。
1材料与方法
1.1试验材料
本试验所用材料采自国家果树种质泰安核桃板栗资源圃，随机从树的不同方位挑取生长发育正常的幼叶，立即液氮速冻，于-70℃超低温冰箱中保存备用。
1.2试剂与耗材
Trizol、EASYspin RN09与Qiagen 3种试剂盒分别购自北京全式金生物技术有限公司、北京艾德莱（Aidlab）生物科技有限公司和德国凯杰公司。试验所用器皿用0.1% DEPC水处理24 h以上，然后高温灭菌；研钵、玻璃器皿等在180℃高温烘烤12 h以上，备用。
1.3试验方法
提取方法均按相应试剂盒说明书进行。RNA溶解后，分别取2 μl样品，1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统下观察RNA条带的完整性，并拍照记录；另分别取1 μl样品，用紫外分光光度计测定230、260、280 nm下的OD值，并计算OD260/OD280、OD260/OD230值及RNA产率。
2结果与分析
2.13种方法提取总RNA的完整性比较
Trizol试剂盒法提取核桃叶片未能得到肉眼可见的白色RNA沉淀，EASYspin试剂盒与Qiagen试剂盒均为离心柱型试剂盒，提取过程中无法判断沉淀量。经琼脂糖凝胶电泳检测，结果（图1）显示，Trizol试剂盒法没有获得RNA，只有少量降解物；EASYspin试剂盒法和Qiagen试剂盒法提取的核桃叶片总RNA均可见28S、18S和5S RNA谱带，其条带清晰、明亮、完整、无拖尾现象，说明提取的RNA浓度较高、获得量较大且完整无降解。EASYspin试剂盒法点样孔处比较干净，说明提取过程中DNA和蛋白质等污染很少；Qiagen试剂盒法点样孔处有少量残留，表明有微量DNA或蛋白质等杂质的污染。综合比较可知，EASYspin试剂盒法提取的RNA质量较高，效果较好。
3结论与讨论
核桃叶片中富含多糖多酚等物质，酚类化合物被氧化后会与RNA不可逆的结合，导致RNA活性丧失或形成不溶性复合物；多糖会形成难溶的胶状物，与RNA共沉淀[4～6]。因此，必须选择去除多糖多酚的方法进行核桃RNA的提取。EASYspin试剂盒中的RNA助提剂PLANTaid能够帮助结合多糖多酚，并通过离心去除，提高清除效果。本试验结果显示，Trizol试剂盒法未能提取到RNA，EASYspin与Qiagen试剂盒法提取过程基本相似，方便快捷，提取RNA的质量与产率相当，且用时较短，整个过程不到1 h，与CTAB等方法[7～10]相比大大缩短了试验时间。此外，与进口的Qiagen试剂盒相比，国产的EASYspin试剂盒价格低廉很多。
因此，EASYspin试剂盒法最适合核桃叶片总RNA的提取，该法获得的RNA完整性好，无降解，纯度和产率较高，试验耗时少，且试剂盒成本较低。本试验结果为核桃cDNA文库的构建、RT-PCR及其他分子生物学研究奠定了良好的基础，也为其他植物材料的RNA提取提供参考。
参考文献：
[1]郗荣庭， 张毅萍. 中国果树志核桃卷[M].北京：中国林业出版社， 1996.
[2]Loomis W D. Overcoming problems of phenolics and quinines in the isolation of plant enzymes and organelles[J]. Meth. Enzymol.， 1974， 31： 528-544.
[3]Logemann J， Schell J， Willmitzer L. Improved method for the isolation of RNA from plant tissues[J]. Anal. Biochem.， 1987， 163（1）： 16-20.
[4]Schneiderbauer A， Sandermann H Jr， Ernst D. Isolation of functional RNA from plant tissues rich in phenolic compounds[J]. Anal. Biochem.， 1991， 197（1）： 91-95.
[5]Graham G C. A method for extraction of total RNA from Pinus radiata and other conifers[J]. Plant Mol. Biol. Repor.， 1993， 11（1）： 32-37.
[6]Lewinsohn E， Steele C L， Croteau R. Simple isolation of functional RNA from woody stems of gymnosperms [J]. Plant Mol. Biol. Repor.， 1994， 12（1）： 20-25.
[7]Zeng Y， Yang T. RNA isolation from highly viscous samples rich in polyphenols and polysaccharides [J]. Plant Mol. Biol. Repor.， 2002， 20（4）：417.
[8]刘晓菊，洪海波，李敏，等. 改良CTAB法提取核桃总RNA试验[J]. 山东农业科学，2008， 1：97-99.
[9]李晓颖，曹雪，房经贵，等. 杏叶片与果实总RNA提取方法研究[J]. 中国农学通报，2010， 26（2）：152-156.
[10]Tinney G W， Pritchard S C， Gonzalez R， et al. Elimination of oxalate contamination in RNA isolation from Rumex obtusifolius[J]. Plant Mol. Biol. Repor.， 2002， 20（3）：309.