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[摘 要]目的：建立高效液相色谱法同时测定乳及乳制品中苯甲酸、山梨酸、安赛蜜和糖精钠含量的方法，为进一步研究乳及乳制品中防腐剂及甜味剂提供依据。 方法：通过加入适量沉淀剂除去样品中绝大部分蛋白质和脂肪后，利用HPLC法对其防腐剂及甜味剂的含量进行测定。色谱条件为： C18色谱柱；紫外检测器；检测波长为230 nm；流动相为甲醇：乙酸铵（0.02mol/L） =98：3；柱温为35℃。结果：回收率在87.65%～102.15%，精密度（RSD）为2.17%～2.42%，检出限分别为1.0，1.0，1.0，1.0 μg/g。该方法可用于乳及乳制品中这4种添加剂的同时测定。
[关键词]苯甲酸；山梨酸钾；安赛蜜；糖精钠；乳及乳制品
中图分类号：TS252.7 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2015）47-0037-02
引言
乳制品安全是我国近年来食品安全的焦点，自“三聚氰胺”事件发生以来，乳制品安全事件不仅暴露了监管和标准的缺失，而且说明乳制品检测新技术有待探讨和普及的迫切性，国家卫生部已对甜味剂和防腐剂的加入量作出了严格的规定[1]，也相继出台了有关的检测标准[2-3]，用在市售的乳制产品中，尤其是酸奶、乳饮料、调味奶中防腐剂和甜味剂往往是共存的，而关于上述四种物质的检测方法有很多，但对于用高效液相系统方法同时进行检测乳及乳制品中这四种添加剂的报道很少。为方便乳及乳制品中添加剂的及时监测，需要建立能够同时测定多种添加剂的简单快速的检测方法。本文从确定最佳吸收波长，选用合适沉淀剂除去样品中脂肪和蛋白质等干扰物质，优化流动相，可同时得到乳及乳制品中的山梨酸钾、苯甲酸、糖精钠和安赛蜜4种添加剂的检测结果，本方法灵敏度高，重现性好，具有更广泛的适用范围。
1 材料和方法
1.1 仪器与试剂
Waters2695高效液相色谱仪（Waters2487紫外检测器），SB25-12DTD型超聲波振荡器（宁波新芝生物科技股份有限公司）、 苯甲酸、糖精钠、安赛蜜、山梨酸的标准物质（纯度≥99%）；乙酸铵水溶液（0.02 mol/L）；乙酸锌水溶液（219 g/L）；亚铁氰化钾水溶液（109 g/L）。
1.2 色谱条件
Agilent-C18 柱（250mm×4.6mm，5 μm），柱温为35 ℃； 检测器为紫外检测器，测定波长为230 nm； 流动相：乙酸铵（0.02 mol/L）：甲醇=97：3；流速为1.0 mL/min。
1.3 样品测定
液态奶、酸奶和乳饮料： 称取25g样品于50ml容量瓶中，然后分别加入5.0ml亚铁氰化钾溶液和5.0ml乙酸鋅溶液混匀，，在超声波振荡器上使其充分混匀后，加水定容，振荡均匀后过滤，最后取滤液进样10μL于高效液相色谱仪上分析定量，以保留时间定性，峰面积定量。
奶粉：称取2.5g样品于50ml容量瓶中，然后加入一级水（20ml、l40℃）溶解，然后分别加入5.0ml亚铁氰化钾溶液和5.0ml乙酸锌溶液混匀，，用超声波振荡器使其充分混匀后，加水定容，振荡均匀后过滤，最后取滤液进样10μL于高效液相色谱仪上分析定量，以保留时间定性，峰面积定量。
标样处理：配制一定浓度的混合标样，分别加入5.0ml亚铁氰化钾溶液和5.0ml乙酸锌溶液混匀，用超声波振荡器使其充分混匀后，加水定容，振荡均匀后过滤，最后取滤液进样10μL于高效液相色谱仪上分析定量，以保留时间定性，峰面积定量。
2 结果与分析
2.1 波长的选择
通过二极管阵列检测器获得的光谱图， 在190～400 nm范围内对分析物进行紫外波长扫描，结果发现，在流动相中4个组分的最大吸收波长分别是糖精钠206 nm、安赛蜜228 nm、山梨酸257 nm、苯甲酸227 nm， 综合考虑国家标准、文献报道、各组分理化特性，故选择230 nm为检测波长。
2.2 标样谱图
图1从左至右峰分别为安赛蜜（AK）、糖精钠（BJS）、苯甲酸（PS）、山梨酸（SS）四种混合标准品的色谱图，由图1看出四种标准品物质完全分离，保留时间分别为8.094，9.992，14.121，18.044min。
图2为奶粉样品中加入4种标准样品后的图谱，由图2可看出四种物质与杂质峰实现了完全分离，组分之间无干扰，可用于准确的定性和定量。
2.3 流动相的优化
最佳流动相的选择应在满足分离效果，达到待测物质与杂质基本分离的条件下，选择能改善待测物质的响应，提高灵敏度的流动相[4]。本实验结果表明甲醇作为流动相组分与乙腈为流动相组分比较，待测物质的灵敏度和响应值都较高，而且对山梨酸和苯甲酸的洗脱能力较强，在满足分离效果较好的条件下，能缩短分析时间。实验还考察了乙酸铵、硫酸铵和柠檬酸铵等溶液作为缓冲溶液时对分离测定的影响[1]，实验结果表明甲醇-乙酸铵作为流动相时其洗脱效果最好，分析时间最短，待测物质的灵敏度和响应值最高。
通过试验改变流动相中缓冲溶液的浓度和组成比例对待测物质色谱峰和分离测定的影响，确定流动相的缓冲溶液的浓度和组成比例。当乙酸铵的浓度为分别为0.01，0.02，0.05 mol/L时，对分离影响不大，但随着乙酸铵浓度的增加，待测物质的出峰时间愈稳定， 考虑到缓冲盐浓度增大，对色谱柱及系统管路造成的损害也会加大，所以选择浓度为0.02 mol/L的乙酸铵作为缓冲溶液。
参考资料研究流动相配比对色谱分离效果，采用甲醇：乙酸铵溶液配比7：93， 5：95，3：97，流动相配比对分离效果的影响实验结果如表1：
几种目标峰可实现基本分离，但苯甲酸的色谱峰附近有杂质干扰 目标峰均可实现完全分离，分离度均大于1.5，无杂质干扰
2.4 沉淀剂的选用和用量
通过试验研究发现亚铁氰化钾和乙酸锌作复合沉淀剂，可除去样品中绝大部分蛋白质和脂肪，效果要比加入碱和硫酸铜沉淀、调节酸碱沉淀等其他方法好[5]。但若沉淀剂加入过多则会给测定带来干扰甚至会导致被测物的丧失；加入太少， 则蛋白质的沉淀不完全影响过滤。经过试验确定了沉淀剂的最佳用量，亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液各加5ml，既能保证初滤液通过微孔滤膜过滤，又能在进样测定时不给检测带来干扰或导致被测物的损失。
2.5 标准曲线和检出限
四种物质的标准曲线、线性关系、线性范围，并以3倍信噪比时的进样浓度计算出了检出限见表2。由表2可看出四种物质浓度和峰面积呈线性关系，相关系数均大于0.9994，检出限均为1.0μg·g-1 。
2.6 方法回收率
以同一个空白乳粉样品为实验样品， 加入一定量的山梨酸、苯甲酸、糖精钠和安赛蜜标准溶液，进行回收实验，每个样品平行测定3次，以平均值计算回收率，回收率结果如表3所示。
2.7 精密度实验
以同一个空白乳粉样品为实验样品， 加入一定量的山梨酸、苯甲酸、糖精钠和安赛蜜标准溶液，平行测定6次，计算測定值的相对标准偏差（RSD），结果如表4所示。由表4可以看出， 测定结果的较为稳定，方法的重复性较好。
3.结论
本文重点研究了沉淀劑及其用量和优化流动相对分析测定的影响，建立了高效液相色谱法同时测定乳及乳制品中山梨酸、苯甲酸、糖精钠和安赛蜜的检测方法。该方法测定结果重现性好，准确度高，简单易操作，适合乳及乳制品中防腐剂和甜味剂的日常检测[6]。
参考文献：
[1] 刘丽敏，彭敏东.5种甜味添加剂的反相高效液相色谱法同时测定[J].分析测试学报，2008，5（1）：549-552.
[2] GB/T 5009.29-2003
[3] GB/T 5009.29-2003
[4] 宋戈，郑伟.高效液相法测定乳及乳制品中多种四环素类药物残留[J].中国乳品工业，2012，8（1）：40-42.
[5] 刘永刚，李朝旭，朱俊平等.乳及乳制品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠检测方法研究[J].食品科学，2007，6（1）：260-262.
[6] 陈静，王玉英，王婷婷等.生鲜牛乳真蛋白快速检测方法，中国乳品工业，2010，11（1）：50-52.
作者简介：
第一作者：肖军（1987-），男，助理工程师，主要研究方向：食品与水化验。通讯作者：郭劲霞（1965-），女，副教授，主要研究方向：生物化学与检验
[关键词]苯甲酸；山梨酸钾；安赛蜜；糖精钠；乳及乳制品
中图分类号：TS252.7 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2015）47-0037-02
引言
乳制品安全是我国近年来食品安全的焦点，自“三聚氰胺”事件发生以来，乳制品安全事件不仅暴露了监管和标准的缺失，而且说明乳制品检测新技术有待探讨和普及的迫切性，国家卫生部已对甜味剂和防腐剂的加入量作出了严格的规定[1]，也相继出台了有关的检测标准[2-3]，用在市售的乳制产品中，尤其是酸奶、乳饮料、调味奶中防腐剂和甜味剂往往是共存的，而关于上述四种物质的检测方法有很多，但对于用高效液相系统方法同时进行检测乳及乳制品中这四种添加剂的报道很少。为方便乳及乳制品中添加剂的及时监测，需要建立能够同时测定多种添加剂的简单快速的检测方法。本文从确定最佳吸收波长，选用合适沉淀剂除去样品中脂肪和蛋白质等干扰物质，优化流动相，可同时得到乳及乳制品中的山梨酸钾、苯甲酸、糖精钠和安赛蜜4种添加剂的检测结果，本方法灵敏度高，重现性好，具有更广泛的适用范围。
1 材料和方法
1.1 仪器与试剂
Waters2695高效液相色谱仪（Waters2487紫外检测器），SB25-12DTD型超聲波振荡器（宁波新芝生物科技股份有限公司）、 苯甲酸、糖精钠、安赛蜜、山梨酸的标准物质（纯度≥99%）；乙酸铵水溶液（0.02 mol/L）；乙酸锌水溶液（219 g/L）；亚铁氰化钾水溶液（109 g/L）。
1.2 色谱条件
Agilent-C18 柱（250mm×4.6mm，5 μm），柱温为35 ℃； 检测器为紫外检测器，测定波长为230 nm； 流动相：乙酸铵（0.02 mol/L）：甲醇=97：3；流速为1.0 mL/min。
1.3 样品测定
液态奶、酸奶和乳饮料： 称取25g样品于50ml容量瓶中，然后分别加入5.0ml亚铁氰化钾溶液和5.0ml乙酸鋅溶液混匀，，在超声波振荡器上使其充分混匀后，加水定容，振荡均匀后过滤，最后取滤液进样10μL于高效液相色谱仪上分析定量，以保留时间定性，峰面积定量。
奶粉：称取2.5g样品于50ml容量瓶中，然后加入一级水（20ml、l40℃）溶解，然后分别加入5.0ml亚铁氰化钾溶液和5.0ml乙酸锌溶液混匀，，用超声波振荡器使其充分混匀后，加水定容，振荡均匀后过滤，最后取滤液进样10μL于高效液相色谱仪上分析定量，以保留时间定性，峰面积定量。
标样处理：配制一定浓度的混合标样，分别加入5.0ml亚铁氰化钾溶液和5.0ml乙酸锌溶液混匀，用超声波振荡器使其充分混匀后，加水定容，振荡均匀后过滤，最后取滤液进样10μL于高效液相色谱仪上分析定量，以保留时间定性，峰面积定量。
2 结果与分析
2.1 波长的选择
通过二极管阵列检测器获得的光谱图， 在190～400 nm范围内对分析物进行紫外波长扫描，结果发现，在流动相中4个组分的最大吸收波长分别是糖精钠206 nm、安赛蜜228 nm、山梨酸257 nm、苯甲酸227 nm， 综合考虑国家标准、文献报道、各组分理化特性，故选择230 nm为检测波长。
2.2 标样谱图
图1从左至右峰分别为安赛蜜（AK）、糖精钠（BJS）、苯甲酸（PS）、山梨酸（SS）四种混合标准品的色谱图，由图1看出四种标准品物质完全分离，保留时间分别为8.094，9.992，14.121，18.044min。
图2为奶粉样品中加入4种标准样品后的图谱，由图2可看出四种物质与杂质峰实现了完全分离，组分之间无干扰，可用于准确的定性和定量。
2.3 流动相的优化
最佳流动相的选择应在满足分离效果，达到待测物质与杂质基本分离的条件下，选择能改善待测物质的响应，提高灵敏度的流动相[4]。本实验结果表明甲醇作为流动相组分与乙腈为流动相组分比较，待测物质的灵敏度和响应值都较高，而且对山梨酸和苯甲酸的洗脱能力较强，在满足分离效果较好的条件下，能缩短分析时间。实验还考察了乙酸铵、硫酸铵和柠檬酸铵等溶液作为缓冲溶液时对分离测定的影响[1]，实验结果表明甲醇-乙酸铵作为流动相时其洗脱效果最好，分析时间最短，待测物质的灵敏度和响应值最高。
通过试验改变流动相中缓冲溶液的浓度和组成比例对待测物质色谱峰和分离测定的影响，确定流动相的缓冲溶液的浓度和组成比例。当乙酸铵的浓度为分别为0.01，0.02，0.05 mol/L时，对分离影响不大，但随着乙酸铵浓度的增加，待测物质的出峰时间愈稳定， 考虑到缓冲盐浓度增大，对色谱柱及系统管路造成的损害也会加大，所以选择浓度为0.02 mol/L的乙酸铵作为缓冲溶液。
参考资料研究流动相配比对色谱分离效果，采用甲醇：乙酸铵溶液配比7：93， 5：95，3：97，流动相配比对分离效果的影响实验结果如表1：
几种目标峰可实现基本分离，但苯甲酸的色谱峰附近有杂质干扰 目标峰均可实现完全分离，分离度均大于1.5，无杂质干扰
2.4 沉淀剂的选用和用量
通过试验研究发现亚铁氰化钾和乙酸锌作复合沉淀剂，可除去样品中绝大部分蛋白质和脂肪，效果要比加入碱和硫酸铜沉淀、调节酸碱沉淀等其他方法好[5]。但若沉淀剂加入过多则会给测定带来干扰甚至会导致被测物的丧失；加入太少， 则蛋白质的沉淀不完全影响过滤。经过试验确定了沉淀剂的最佳用量，亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液各加5ml，既能保证初滤液通过微孔滤膜过滤，又能在进样测定时不给检测带来干扰或导致被测物的损失。
2.5 标准曲线和检出限
四种物质的标准曲线、线性关系、线性范围，并以3倍信噪比时的进样浓度计算出了检出限见表2。由表2可看出四种物质浓度和峰面积呈线性关系，相关系数均大于0.9994，检出限均为1.0μg·g-1 。
2.6 方法回收率
以同一个空白乳粉样品为实验样品， 加入一定量的山梨酸、苯甲酸、糖精钠和安赛蜜标准溶液，进行回收实验，每个样品平行测定3次，以平均值计算回收率，回收率结果如表3所示。
2.7 精密度实验
以同一个空白乳粉样品为实验样品， 加入一定量的山梨酸、苯甲酸、糖精钠和安赛蜜标准溶液，平行测定6次，计算測定值的相对标准偏差（RSD），结果如表4所示。由表4可以看出， 测定结果的较为稳定，方法的重复性较好。
3.结论
本文重点研究了沉淀劑及其用量和优化流动相对分析测定的影响，建立了高效液相色谱法同时测定乳及乳制品中山梨酸、苯甲酸、糖精钠和安赛蜜的检测方法。该方法测定结果重现性好，准确度高，简单易操作，适合乳及乳制品中防腐剂和甜味剂的日常检测[6]。
参考文献：
[1] 刘丽敏，彭敏东.5种甜味添加剂的反相高效液相色谱法同时测定[J].分析测试学报，2008，5（1）：549-552.
[2] GB/T 5009.29-2003
[3] GB/T 5009.29-2003
[4] 宋戈，郑伟.高效液相法测定乳及乳制品中多种四环素类药物残留[J].中国乳品工业，2012，8（1）：40-42.
[5] 刘永刚，李朝旭，朱俊平等.乳及乳制品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠检测方法研究[J].食品科学，2007，6（1）：260-262.
[6] 陈静，王玉英，王婷婷等.生鲜牛乳真蛋白快速检测方法，中国乳品工业，2010，11（1）：50-52.
作者简介：
第一作者：肖军（1987-），男，助理工程师，主要研究方向：食品与水化验。通讯作者：郭劲霞（1965-），女，副教授，主要研究方向：生物化学与检验