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中图分类号 R284.2；Q946.91 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）23-3208-05
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.23.09
摘 要 目的：分离纯化并鉴定4′ ，7-二乙基射干苷元合成产物中的杂质，为其质量控制提供依据。方法：采用液相色谱-串联质谱法分析4′ ，7-二乙基射干苷元合成产物中的杂质，然后根据各杂质离子峰的质荷比[M+H]+推定其可能结构；采用硅胶柱层析，以氯仿-甲醇（梯度洗脱，20 ∶ 1、10 ∶ 1、8 ∶ 1、6 ∶ 1、5 ∶ 1、3 ∶ 1、2 ∶ 1、1 ∶ 1、0 ∶ 1，V/V）分离纯化部分杂质，并采用紫外、红外、核磁共振波谱等技术鉴定其结构。结果：在4′ ，7-二乙基射干苷元合成产物中共检出21个杂质，推定出17个杂质的可能结构；分离纯化得到4个杂质单体，分别鉴定为2-羟基-3-甲氧基-4，6，4′ -三乙氧基脱氧安息香（1）、2，6-二羟基-3-甲氧基-4，4′ -二乙氧基脱氧安息香（2）、射干苷元（3）和射干苷（4），其中杂质2为新化合物。结论：本结果可为4′ ，7-二乙基射干苷元的合成工艺优化及质量控制提供重要依据。
关键词 4′ ，7-二乙基射干苷元；杂质；液相色谱-串联质谱法；鉴定；纯化
ABSTRACT OBJECTIVE： To isolate， purify and identify the impurities in the synthesis products of 4′ ，7-diethyl tectorigenin， and to provide reference for its quality control. METHODS： LC-MS/MS was adopted to analyze the impurities in the synthesis products of 4′ ，7-diethyl tectorigenin； the potential structure of each impurity was deduced according to mass-charge ratio [M+H]+ of ion peak. The major impurities were isolated by silica gel column chromatography using chloroform-methanol （gradient elution， 20 ∶ 1， 10 ∶ 1， 8 ∶ 1， 6 ∶ 1， 5 ∶ 1， 3 ∶ 1， 2 ∶ 1， 1 ∶ 1， 0 ∶ 1， V/V）. The structures of the impurities were identified by UV spectroscopy， IR spectroscopy and NMR. RESULTS： Totally 21 impurities were detected in the synthesis products of 4′ ，7-diethyl tectorigenin. The potential structures of 17 impurities were elucidated； 4 impurity monomers were isolated and purified. The impurities were identified as 2-hydroxy-3-methoxy-4，6，4′ -triethoxy deoxybenzoin （1）， 2，6-dihydroxy-3-methoxy-4，4′ -diethoxy deoxybenzoin （2）， tectorigenin （3） and tectoridin （4）. impurity 2 was reported for the first time. CONCLUSIONS： The result can provide important evidence for the optimization of synthesis process and quality control of 4′ ，7-diethyl tectorigenin.
KEYWORDS 4′ ，7-diethyl tectorigenin； Impurity； LC-MS/MS； Identification； Putification
4′ ，7-二乙基射干苷元（4′ ，7-diethyl tectorigenin）即5-羟基-6-甲氧基-4′ ，7-二乙氧基异黄酮，是中药川射干（Iris tectorum Maxim.）中主要有效成分射干苷元经结构修饰后得到的新型抗病毒候选药物，具有较强的抗柯萨奇病毒作用，可用于治疗由柯萨奇病毒感染引起的心肌炎、小儿肺炎、无菌性脑膜炎、手足口病等[1-3]。
4′ ，7-二乙基射干苷元是由四川省中医药科学院自主研发，经川射干药材提取分离出射干苷，再水解得到射干苷元，然后在强碱性条件下与硫酸二乙酯反应得到4′ ，7-二乙基射干苷元[2]。由于在4′ ，7-二乙基射干苷元的合成过程中不可避免地会产生杂质，为了控制其合成产物的质量，笔者采用液相色谱-串联质谱（MS）法分析4′ ，7-二乙基射干苷元合成产物中的杂质；通过硅胶柱层析法分离部分杂质，并鉴定其化学结构，为4′ ，7-二乙基射干苷元的合成工艺优化及质量控制提供重要依据。
1 材料
1.1 仪器
RRLC-6410液质联用仪（美国Agilent公司）；AVⅡ核磁共振波谱（NMR）仪（德国Bruker公司）；UV-2401PC紫外（UV）分光光度仪、FTIR8300红外（IR）检测仪（日本Shimadzu公司）；WRS-2微機熔点测定仪（上海易测仪器设备有限公司）；CPA225D电子天平（德国赛多利斯公司）。 1.2 药品与试剂
川射干（四川省新荷花中药饮片股份有限公司，批号：20131125）由四川省中医药科学院中药种植与资源研究所舒光明研究员鉴定为真品；4′ ，7-二乙基射干苷元对照品（自制，批号：20131001，纯度：99.48%）；乙酸铵（批号：20140305）、氢氧化钠（NaOH，批号：20140801）、盐酸（批号：20140604）、硫酸二乙酯（批号：20140602）、氯仿（批号：20140708）、甲醇（批号：20131204）均购自成都市科龙化工试剂厂；二甲基亚砜（DMSO）、乙腈均为色谱纯，水为超纯水。
2 方法
2.1 色谱及质谱条件
2.1.1 色谱条件 色谱柱为Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，1.8 μm）；流动相为乙腈-10 mmol/L乙酸胺水溶液（30 ∶ 70，V/V）；流速为0.3 mL/min；柱温为30 ℃；进样量为10 ?L。
2.1.2 质谱条件 离子源为电喷雾离子源（+），喷雾电压4 000 V，源温度为100 ℃，雾化气为氮气，雾化压力为15 psi，去溶剂气为氮气，温度为300 ℃，流速为10 L/min，碰撞气为高纯氮气，压力为0.1 MPa；采用全扫描模式对合成产物进行检测。
2.2 射干苷元的制备
将川射干药材粉碎过20目筛，加4倍药材量70%乙醇加热回流3次，每次1 h，趁热过滤，合并滤液；60 ℃减压回收乙醇后，得棕黄色浸膏。将所得浸膏加入适量95%乙醇搅拌均匀，静置沉淀，过滤得射干苷粗品。再取射干苷粗品，加95%乙醇加热回流1 h，静置过夜，析出淡黄色沉淀，过滤，沉淀再用95%乙醇加热回流1次，得射干苷。取射干苷100 g置于1 000 mL圆底烧瓶中，加500 mL 50%乙醇搅拌均匀，再加50 mL盐酸，加热回流6 h，趁热过滤；将滤液静置过夜，析出淡黄色沉淀，过滤；用水洗涤沉淀至流出液pH=6～7时，60 ℃减压干燥得淡黄色射干苷元粉末，纯度为95.52%。
2.3 4′ ，7-二乙基射干苷元的合成
取“2.2”项下制备的射干苷元10 g、NaOH 2 g及95%乙醇50 mL置于500 mL圆底烧瓶中，于水浴中加热沸腾5 min，再加入10 mL硫酸二乙酯，反应20 min后，立即用盐酸调pH至6～7，加200 mL水搅拌，置冷，析出沉淀，过滤；沉淀经洗涤后，60 ℃减压干燥，即得4′ ，7-二乙基射干苷元合成产物。
2.4 4′ ，7-二乙基射干苷元合成产物中的杂质分析
2.4.1 对照品溶液的制备 取4′ ，7-二乙基射干苷元对照品适量于100 mL量瓶中，加甲醇超声（功率：400 W，频率：58 kHz，下同）溶解并定容，摇匀，即得。
2.4.2 供试品溶液的制备 取“2.3”项下4′ ，7-二乙基射干苷元合成产物5 mg至100 mL量瓶中，加甲醇超声溶解并定容，摇匀，即得。
2.4.3 杂质分析 分别取“2.4.1”“2.4.2”项下制备的对照品溶液和供试品溶液，根据“2.1”项下条件进样分析，记录总离子流图和质谱信息（保留时间和质荷比[M+H]+）。
2.5 4′ ，7-二乙基射干苷元合成产物中杂质的分离
取“2.3”项下4′ ，7-二乙基射干苷元合成产物1.0 g，用20 mL 95%乙醇溶解，过滤，滤液60 ℃减压浓缩至5 mL，用5 g 80目硅胶拌匀吸附，干燥，研细，作为上柱样品。样品用200～300目硅胶柱层析，采用氯仿湿法装柱[4]，氯仿-甲醇梯度洗脱（20 ∶ 1、10 ∶ 1、8 ∶ 1、6 ∶ 1、5 ∶ 1、3 ∶ 1、2 ∶ 1、1 ∶ 1、0 ∶ 1，V/V），收集洗脱液（每50 mL为一份）。根据薄层色谱[展开剂：氯仿-甲醇-甲酸（10 ∶ 1 ∶ 0.2，V/V/V）]的检测结果，合并比移值相等的流份，减压回收溶剂至干，再重结晶，即得部分杂质的单体化合物。测定各单体化合物的熔点（mp）、UV、IR、ESI-MS、1H- NMR及13C-NMR等相关数据，并对其结构进行推定和鉴定。
3 结果
3.1 4′ ，7-二乙基射干苷元合成产物中的杂质分析结果
4′ ，7-二乙基射干苷元对照品溶液的离子流图见图1A；4′ ，7-二乙基射干苷元合成产物的离子流图见图1B。
由图1B可知，合成产物中有22个化合物（编号：1～22号）其中包括目标产物4′ ，7-二乙基射干苷元（13号），其余为合成产物中的杂质。4′ ，7-二乙基射干苷元合成产物的质谱信息见表1。
3.2 部分杂质的结构推定
4′ ，7-二乙基射干苷元化学名为4′ ，5，7-三羟基-6-甲氧基异黄酮，含有3个酚羟基；理论上，其与硫酸二乙酯进行乙基化反应时应有7个反应产物生成，即一乙基射干苷元类化合物3个，二乙基射干苷元类化合物3个，三乙基射干苷元1个。相关文献报道[5-6]，异黄酮类化合物在强碱性条件下，可降解为脱氧安息香类化合物（即异黄酮C环开环衍生物，含有4个酚羟基）和苯乙酮类化合物等。根据各杂质离子峰的[M+H]+，推定各杂质的可能结构[7]。合成产物中部分杂质的结构推定结果见表2。
从表2可知，4′ ，7-二乙基射干苷元合成产物中的杂质，是由于射干苷元含有多个酚羟基造成取代基位置及个数的不同，以及射干苷元在强碱条件下C环发生开环而产生。推定出17个杂质的可能结构，而9、10、16、22号杂质，根据其离子峰的[M+H]+和文献资料，不足以确定其结构，故不作讨论。
3.3 部分杂质的结构鉴定
根据“2.5”项下方法分离得到4个雜质单体化合物，化合物1（20 mg）、7（80 mg）、19（20 mg）、21（40 mg）。 化合物1：淡黄色针晶（甲醇）。mp：214～216 ℃；电喷雾电离ESI-MS（m/z）：299[M-H]-；1H-NMR（DMSO，400 MHz）δ：13.09（1H，s，5-OH），10.77（1H，s，7-OH），9.58（1H，s，4′ -OH），8.34（1H，s，H-2），7.37（2H，d，J=8.5 Hz，H-2′ ，6′ ），6.82（2H，d，J=8.5 Hz，H-3′ ，5′ ），6.50（1H，s，H-8），3.74（3H，s，6-OCH3）。以上理化性质和光谱数据与文献报道[3]基本一致，因此，鉴定化合物为射干苷元。
化合物7：淡黄色结晶性粉末（无水乙醇）。mp：137～138 ℃；UVλmax：288 nm；IRνmax：1 636，1 612，1 585， 1 516，1 500，1 400，1 344，1 248，1 190，1 020；ESI-MS（m/z）：347[M+H]+；1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ：13.32（1H，s，6-OH），7.17（2H，d，J=8.4 Hz，H-2′ ，H-6′ ），6.87（1H，s，2-OH），6.86（2H，d，J=8.4 Hz，H-3′ ，H-5′ ），6.03（1H，s，H-5），4.36（2H，s，-CH2-），4.10（2H，q，4-CH2），4.02（2H，q，4′ -CH2），3.86（3H，s，6-OCH3），1.47（3H，t，4-CH3），1.40（3H，t，4′ -CH3）；13C-NMR（CDCl3，400 MHz）δ：103.5（C-1），157.8（C-2），127.9（C-3），151.2（C-4），93.2（C-5），157.6（C-6），48.6（C-7），203.1（C-8），126.9（C-1′ ），130.8（C-2′ ，6′ ），114.4（C-3′ ，5′ ），162.1（C- 4′ ），14.6，63.4（4′ -OCH2CH3），14.8，64.4（4-OCH2CH3）。以上理化性质和光谱数据与文献报道[4]基本一致，因此，鉴定化合物为2，6-二羟基-3-甲氧基-4，4′ -二乙氧基脱氧安息香。
化合物19：白色结晶性粉末（70%乙醇）。mp：252～253 ℃；ESI-MS（m/z）：461[M-H]-；1H-NMR（DMSO，400 MHz）δ：12.92（1H，s，5-OH），9.58（1H，s，4′ -OH），8.44（1H，s，H-2），7.39（2H，d，J=8.5 Hz，H-2′ ，6′ ），6.82（2H，d，J=8.5 Hz，H-3′ ，5′ ），6.85（1H，s，H-8），5.07（1H，d，J=8.0Hz，H-1″ ），3.80（3H，s，6-OCH3）。以上理化性质和光谱数据与文献报道[3]基本一致，因此，鉴定化合物为射干苷。
化合物21：白色晶体（无水乙醇）。mp：107～109 ℃；UVλmax：283 nm；ESI-MS（m/z）：375[M+H]+；IRνmax：2 986，1 618，1 587，1 574，1 489，1 476，1 387，1 344， 1 260，1 242，1 190，1 161；1H-NMR（CDCl3，400 MHz） δ：13.24（1H，s，2-OH），7.14（2H，d，J=8.4 Hz，H-2′ ，6′ ），6.87（2H，d，J=8.4 Hz，H-3′ ，H-5′ ），6.21（1H，s，H-5），4.36（2H，s，7-CH2），4.28（2H，q，4-CH2），4.10（3H，t，4′ -CH3），4.09（2H，q，6-CH2），4.02（2H，q，4′ -CH2），3.79（3H，s，3-OCH3），1.47（3H，t，4-CH3），1.45（3H，t，6-CH3）；13C-NMR（CDCl3，600 MHz） δ：111.0（C-1），158.9（C-2），131.3（C-3），152.8（C-4），97.2（C-5），157.7（C-6），48.9（C-7），203.1（C-8），127.4（C-1′ ），135.1（C-2′ ，6′ ），114.5（C-3′ ，5′ ），158.1（C-4′ ），14.9，63.3（4′ - OCH2CH3），15.1，64.6（4-OCH2CH3），16.0，70.1（6- OCH2CH3）。鉴定此化合物为2-羟基-3-甲氧基-4，6，4′ -三乙氧基脱氧安息香（新化合物）。
根据各化合物的mp、UV、IR、ESI-MS、1H-NMR及13C-NMR等相关数据，确定其化学结构，各化合物结构式见图2。
4 讨论
在化合物的制备反应过程中会不可避免地产生杂质，故研究合成产物的杂质，有利于了解合成的原理、过程以及合成方法的合理性，以期对工艺进行评判及改进。从本研究的试验结果可知，4′ ，7-二乙基射干苷元合成产物的杂质过多，射干苷元乙基化反应，可先后生成一乙基、二乙基、三乙基射干苷元类化合物；合成产物中检出大量的射干苷元C环开环类化合物，可能的原因是反应时间过长，氢氧化钠用量过多，本课题组在后续的合成工艺优化中也会进一步探究。已上市药物的制剂或原料药的杂质研究文献报道较多[8-12]，但不能直接反映化合物合成情况，且由于杂质含量较低（在原料药中多在1%以下），故杂质的分离纯化比较困难，对其结构大多只能推测。本研究将4′，7-二乙基射干苷元合成产物直接进行LC-MS/MS测定，结果可直观地反映出合成的情况，且分离得到部分杂质并鉴定了其化学结构，可为4′，7-二乙基射干苷元合成产物的杂质分析提供对照品，为其质量控制奠定基础。
参考文献
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[ 5 ] 林启寿.中草药成分化学[M].北京：科學出版社，1977：326-328.
[ 6 ] 余亚纲，汪聪慧，刘岱，等.中药射干亲脂中性成分研究[J].药学学报，1983，18（12）：969-972.
[ 7 ] 宋志军，张沛，梁健，等.川射干异黄酮成分的ESI-MS-MS快速分析[J].质谱学报，2009，30（11）：69-70.
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[10] 左文飞，潘娜，范雪平，等.泮托拉唑钠杂质校正因子的测定[J].中国药学杂志，2012，47（24）：2029-2031.
[11] 陈红，杨梅，张姮婕，等.二维超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术鉴定氯化琥珀胆碱原料药中的杂质[J].中国药房，2018，29（7）：941-944.
[12] 仲婕，朱德领，李保山，等. HPLC法测定尼鲁米特原料药的含量和杂质[J].中国药房，2014，25（1）：61-63.
（收稿日期：2018-08-01 修回日期：2018-10-10）
（编辑：唐晓莲）
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.23.09
摘 要 目的：分离纯化并鉴定4′ ，7-二乙基射干苷元合成产物中的杂质，为其质量控制提供依据。方法：采用液相色谱-串联质谱法分析4′ ，7-二乙基射干苷元合成产物中的杂质，然后根据各杂质离子峰的质荷比[M+H]+推定其可能结构；采用硅胶柱层析，以氯仿-甲醇（梯度洗脱，20 ∶ 1、10 ∶ 1、8 ∶ 1、6 ∶ 1、5 ∶ 1、3 ∶ 1、2 ∶ 1、1 ∶ 1、0 ∶ 1，V/V）分离纯化部分杂质，并采用紫外、红外、核磁共振波谱等技术鉴定其结构。结果：在4′ ，7-二乙基射干苷元合成产物中共检出21个杂质，推定出17个杂质的可能结构；分离纯化得到4个杂质单体，分别鉴定为2-羟基-3-甲氧基-4，6，4′ -三乙氧基脱氧安息香（1）、2，6-二羟基-3-甲氧基-4，4′ -二乙氧基脱氧安息香（2）、射干苷元（3）和射干苷（4），其中杂质2为新化合物。结论：本结果可为4′ ，7-二乙基射干苷元的合成工艺优化及质量控制提供重要依据。
关键词 4′ ，7-二乙基射干苷元；杂质；液相色谱-串联质谱法；鉴定；纯化
ABSTRACT OBJECTIVE： To isolate， purify and identify the impurities in the synthesis products of 4′ ，7-diethyl tectorigenin， and to provide reference for its quality control. METHODS： LC-MS/MS was adopted to analyze the impurities in the synthesis products of 4′ ，7-diethyl tectorigenin； the potential structure of each impurity was deduced according to mass-charge ratio [M+H]+ of ion peak. The major impurities were isolated by silica gel column chromatography using chloroform-methanol （gradient elution， 20 ∶ 1， 10 ∶ 1， 8 ∶ 1， 6 ∶ 1， 5 ∶ 1， 3 ∶ 1， 2 ∶ 1， 1 ∶ 1， 0 ∶ 1， V/V）. The structures of the impurities were identified by UV spectroscopy， IR spectroscopy and NMR. RESULTS： Totally 21 impurities were detected in the synthesis products of 4′ ，7-diethyl tectorigenin. The potential structures of 17 impurities were elucidated； 4 impurity monomers were isolated and purified. The impurities were identified as 2-hydroxy-3-methoxy-4，6，4′ -triethoxy deoxybenzoin （1）， 2，6-dihydroxy-3-methoxy-4，4′ -diethoxy deoxybenzoin （2）， tectorigenin （3） and tectoridin （4）. impurity 2 was reported for the first time. CONCLUSIONS： The result can provide important evidence for the optimization of synthesis process and quality control of 4′ ，7-diethyl tectorigenin.
KEYWORDS 4′ ，7-diethyl tectorigenin； Impurity； LC-MS/MS； Identification； Putification
4′ ，7-二乙基射干苷元（4′ ，7-diethyl tectorigenin）即5-羟基-6-甲氧基-4′ ，7-二乙氧基异黄酮，是中药川射干（Iris tectorum Maxim.）中主要有效成分射干苷元经结构修饰后得到的新型抗病毒候选药物，具有较强的抗柯萨奇病毒作用，可用于治疗由柯萨奇病毒感染引起的心肌炎、小儿肺炎、无菌性脑膜炎、手足口病等[1-3]。
4′ ，7-二乙基射干苷元是由四川省中医药科学院自主研发，经川射干药材提取分离出射干苷，再水解得到射干苷元，然后在强碱性条件下与硫酸二乙酯反应得到4′ ，7-二乙基射干苷元[2]。由于在4′ ，7-二乙基射干苷元的合成过程中不可避免地会产生杂质，为了控制其合成产物的质量，笔者采用液相色谱-串联质谱（MS）法分析4′ ，7-二乙基射干苷元合成产物中的杂质；通过硅胶柱层析法分离部分杂质，并鉴定其化学结构，为4′ ，7-二乙基射干苷元的合成工艺优化及质量控制提供重要依据。
1 材料
1.1 仪器
RRLC-6410液质联用仪（美国Agilent公司）；AVⅡ核磁共振波谱（NMR）仪（德国Bruker公司）；UV-2401PC紫外（UV）分光光度仪、FTIR8300红外（IR）检测仪（日本Shimadzu公司）；WRS-2微機熔点测定仪（上海易测仪器设备有限公司）；CPA225D电子天平（德国赛多利斯公司）。 1.2 药品与试剂
川射干（四川省新荷花中药饮片股份有限公司，批号：20131125）由四川省中医药科学院中药种植与资源研究所舒光明研究员鉴定为真品；4′ ，7-二乙基射干苷元对照品（自制，批号：20131001，纯度：99.48%）；乙酸铵（批号：20140305）、氢氧化钠（NaOH，批号：20140801）、盐酸（批号：20140604）、硫酸二乙酯（批号：20140602）、氯仿（批号：20140708）、甲醇（批号：20131204）均购自成都市科龙化工试剂厂；二甲基亚砜（DMSO）、乙腈均为色谱纯，水为超纯水。
2 方法
2.1 色谱及质谱条件
2.1.1 色谱条件 色谱柱为Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，1.8 μm）；流动相为乙腈-10 mmol/L乙酸胺水溶液（30 ∶ 70，V/V）；流速为0.3 mL/min；柱温为30 ℃；进样量为10 ?L。
2.1.2 质谱条件 离子源为电喷雾离子源（+），喷雾电压4 000 V，源温度为100 ℃，雾化气为氮气，雾化压力为15 psi，去溶剂气为氮气，温度为300 ℃，流速为10 L/min，碰撞气为高纯氮气，压力为0.1 MPa；采用全扫描模式对合成产物进行检测。
2.2 射干苷元的制备
将川射干药材粉碎过20目筛，加4倍药材量70%乙醇加热回流3次，每次1 h，趁热过滤，合并滤液；60 ℃减压回收乙醇后，得棕黄色浸膏。将所得浸膏加入适量95%乙醇搅拌均匀，静置沉淀，过滤得射干苷粗品。再取射干苷粗品，加95%乙醇加热回流1 h，静置过夜，析出淡黄色沉淀，过滤，沉淀再用95%乙醇加热回流1次，得射干苷。取射干苷100 g置于1 000 mL圆底烧瓶中，加500 mL 50%乙醇搅拌均匀，再加50 mL盐酸，加热回流6 h，趁热过滤；将滤液静置过夜，析出淡黄色沉淀，过滤；用水洗涤沉淀至流出液pH=6～7时，60 ℃减压干燥得淡黄色射干苷元粉末，纯度为95.52%。
2.3 4′ ，7-二乙基射干苷元的合成
取“2.2”项下制备的射干苷元10 g、NaOH 2 g及95%乙醇50 mL置于500 mL圆底烧瓶中，于水浴中加热沸腾5 min，再加入10 mL硫酸二乙酯，反应20 min后，立即用盐酸调pH至6～7，加200 mL水搅拌，置冷，析出沉淀，过滤；沉淀经洗涤后，60 ℃减压干燥，即得4′ ，7-二乙基射干苷元合成产物。
2.4 4′ ，7-二乙基射干苷元合成产物中的杂质分析
2.4.1 对照品溶液的制备 取4′ ，7-二乙基射干苷元对照品适量于100 mL量瓶中，加甲醇超声（功率：400 W，频率：58 kHz，下同）溶解并定容，摇匀，即得。
2.4.2 供试品溶液的制备 取“2.3”项下4′ ，7-二乙基射干苷元合成产物5 mg至100 mL量瓶中，加甲醇超声溶解并定容，摇匀，即得。
2.4.3 杂质分析 分别取“2.4.1”“2.4.2”项下制备的对照品溶液和供试品溶液，根据“2.1”项下条件进样分析，记录总离子流图和质谱信息（保留时间和质荷比[M+H]+）。
2.5 4′ ，7-二乙基射干苷元合成产物中杂质的分离
取“2.3”项下4′ ，7-二乙基射干苷元合成产物1.0 g，用20 mL 95%乙醇溶解，过滤，滤液60 ℃减压浓缩至5 mL，用5 g 80目硅胶拌匀吸附，干燥，研细，作为上柱样品。样品用200～300目硅胶柱层析，采用氯仿湿法装柱[4]，氯仿-甲醇梯度洗脱（20 ∶ 1、10 ∶ 1、8 ∶ 1、6 ∶ 1、5 ∶ 1、3 ∶ 1、2 ∶ 1、1 ∶ 1、0 ∶ 1，V/V），收集洗脱液（每50 mL为一份）。根据薄层色谱[展开剂：氯仿-甲醇-甲酸（10 ∶ 1 ∶ 0.2，V/V/V）]的检测结果，合并比移值相等的流份，减压回收溶剂至干，再重结晶，即得部分杂质的单体化合物。测定各单体化合物的熔点（mp）、UV、IR、ESI-MS、1H- NMR及13C-NMR等相关数据，并对其结构进行推定和鉴定。
3 结果
3.1 4′ ，7-二乙基射干苷元合成产物中的杂质分析结果
4′ ，7-二乙基射干苷元对照品溶液的离子流图见图1A；4′ ，7-二乙基射干苷元合成产物的离子流图见图1B。
由图1B可知，合成产物中有22个化合物（编号：1～22号）其中包括目标产物4′ ，7-二乙基射干苷元（13号），其余为合成产物中的杂质。4′ ，7-二乙基射干苷元合成产物的质谱信息见表1。
3.2 部分杂质的结构推定
4′ ，7-二乙基射干苷元化学名为4′ ，5，7-三羟基-6-甲氧基异黄酮，含有3个酚羟基；理论上，其与硫酸二乙酯进行乙基化反应时应有7个反应产物生成，即一乙基射干苷元类化合物3个，二乙基射干苷元类化合物3个，三乙基射干苷元1个。相关文献报道[5-6]，异黄酮类化合物在强碱性条件下，可降解为脱氧安息香类化合物（即异黄酮C环开环衍生物，含有4个酚羟基）和苯乙酮类化合物等。根据各杂质离子峰的[M+H]+，推定各杂质的可能结构[7]。合成产物中部分杂质的结构推定结果见表2。
从表2可知，4′ ，7-二乙基射干苷元合成产物中的杂质，是由于射干苷元含有多个酚羟基造成取代基位置及个数的不同，以及射干苷元在强碱条件下C环发生开环而产生。推定出17个杂质的可能结构，而9、10、16、22号杂质，根据其离子峰的[M+H]+和文献资料，不足以确定其结构，故不作讨论。
3.3 部分杂质的结构鉴定
根据“2.5”项下方法分离得到4个雜质单体化合物，化合物1（20 mg）、7（80 mg）、19（20 mg）、21（40 mg）。 化合物1：淡黄色针晶（甲醇）。mp：214～216 ℃；电喷雾电离ESI-MS（m/z）：299[M-H]-；1H-NMR（DMSO，400 MHz）δ：13.09（1H，s，5-OH），10.77（1H，s，7-OH），9.58（1H，s，4′ -OH），8.34（1H，s，H-2），7.37（2H，d，J=8.5 Hz，H-2′ ，6′ ），6.82（2H，d，J=8.5 Hz，H-3′ ，5′ ），6.50（1H，s，H-8），3.74（3H，s，6-OCH3）。以上理化性质和光谱数据与文献报道[3]基本一致，因此，鉴定化合物为射干苷元。
化合物7：淡黄色结晶性粉末（无水乙醇）。mp：137～138 ℃；UVλmax：288 nm；IRνmax：1 636，1 612，1 585， 1 516，1 500，1 400，1 344，1 248，1 190，1 020；ESI-MS（m/z）：347[M+H]+；1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ：13.32（1H，s，6-OH），7.17（2H，d，J=8.4 Hz，H-2′ ，H-6′ ），6.87（1H，s，2-OH），6.86（2H，d，J=8.4 Hz，H-3′ ，H-5′ ），6.03（1H，s，H-5），4.36（2H，s，-CH2-），4.10（2H，q，4-CH2），4.02（2H，q，4′ -CH2），3.86（3H，s，6-OCH3），1.47（3H，t，4-CH3），1.40（3H，t，4′ -CH3）；13C-NMR（CDCl3，400 MHz）δ：103.5（C-1），157.8（C-2），127.9（C-3），151.2（C-4），93.2（C-5），157.6（C-6），48.6（C-7），203.1（C-8），126.9（C-1′ ），130.8（C-2′ ，6′ ），114.4（C-3′ ，5′ ），162.1（C- 4′ ），14.6，63.4（4′ -OCH2CH3），14.8，64.4（4-OCH2CH3）。以上理化性质和光谱数据与文献报道[4]基本一致，因此，鉴定化合物为2，6-二羟基-3-甲氧基-4，4′ -二乙氧基脱氧安息香。
化合物19：白色结晶性粉末（70%乙醇）。mp：252～253 ℃；ESI-MS（m/z）：461[M-H]-；1H-NMR（DMSO，400 MHz）δ：12.92（1H，s，5-OH），9.58（1H，s，4′ -OH），8.44（1H，s，H-2），7.39（2H，d，J=8.5 Hz，H-2′ ，6′ ），6.82（2H，d，J=8.5 Hz，H-3′ ，5′ ），6.85（1H，s，H-8），5.07（1H，d，J=8.0Hz，H-1″ ），3.80（3H，s，6-OCH3）。以上理化性质和光谱数据与文献报道[3]基本一致，因此，鉴定化合物为射干苷。
化合物21：白色晶体（无水乙醇）。mp：107～109 ℃；UVλmax：283 nm；ESI-MS（m/z）：375[M+H]+；IRνmax：2 986，1 618，1 587，1 574，1 489，1 476，1 387，1 344， 1 260，1 242，1 190，1 161；1H-NMR（CDCl3，400 MHz） δ：13.24（1H，s，2-OH），7.14（2H，d，J=8.4 Hz，H-2′ ，6′ ），6.87（2H，d，J=8.4 Hz，H-3′ ，H-5′ ），6.21（1H，s，H-5），4.36（2H，s，7-CH2），4.28（2H，q，4-CH2），4.10（3H，t，4′ -CH3），4.09（2H，q，6-CH2），4.02（2H，q，4′ -CH2），3.79（3H，s，3-OCH3），1.47（3H，t，4-CH3），1.45（3H，t，6-CH3）；13C-NMR（CDCl3，600 MHz） δ：111.0（C-1），158.9（C-2），131.3（C-3），152.8（C-4），97.2（C-5），157.7（C-6），48.9（C-7），203.1（C-8），127.4（C-1′ ），135.1（C-2′ ，6′ ），114.5（C-3′ ，5′ ），158.1（C-4′ ），14.9，63.3（4′ - OCH2CH3），15.1，64.6（4-OCH2CH3），16.0，70.1（6- OCH2CH3）。鉴定此化合物为2-羟基-3-甲氧基-4，6，4′ -三乙氧基脱氧安息香（新化合物）。
根据各化合物的mp、UV、IR、ESI-MS、1H-NMR及13C-NMR等相关数据，确定其化学结构，各化合物结构式见图2。
4 讨论
在化合物的制备反应过程中会不可避免地产生杂质，故研究合成产物的杂质，有利于了解合成的原理、过程以及合成方法的合理性，以期对工艺进行评判及改进。从本研究的试验结果可知，4′ ，7-二乙基射干苷元合成产物的杂质过多，射干苷元乙基化反应，可先后生成一乙基、二乙基、三乙基射干苷元类化合物；合成产物中检出大量的射干苷元C环开环类化合物，可能的原因是反应时间过长，氢氧化钠用量过多，本课题组在后续的合成工艺优化中也会进一步探究。已上市药物的制剂或原料药的杂质研究文献报道较多[8-12]，但不能直接反映化合物合成情况，且由于杂质含量较低（在原料药中多在1%以下），故杂质的分离纯化比较困难，对其结构大多只能推测。本研究将4′，7-二乙基射干苷元合成产物直接进行LC-MS/MS测定，结果可直观地反映出合成的情况，且分离得到部分杂质并鉴定了其化学结构，可为4′，7-二乙基射干苷元合成产物的杂质分析提供对照品，为其质量控制奠定基础。
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（收稿日期：2018-08-01 修回日期：2018-10-10）
（编辑：唐晓莲）