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摘要 目的：探究姜黃素对结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭以及上皮间质转化的影响。方法：取结直肠癌HCT116细胞系，随机分为对照组和观察组，观察组细胞使用姜黄素50 μg/mL处理，对照组给予等量二甲基亚砜处理;采用噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖;划痕愈合实验检测细胞迁移;Transwell实验检测细胞侵袭;蛋白免疫印迹法（Western Blotting）检测细胞中上皮性钙黏蛋白（E-cadherin）、神经性钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、磷酸化Jagged 1蛋白（p-JAG1）、磷酸化Notch受体1蛋白（p-Notch1）以及磷酸化Notch受体2蛋白（p-Notch2）表达水平。结果：MTT法检测显示，姜黄素可显著抑制HCT116细胞增殖。划痕愈合实验以及Transwell实验显示姜黄素可显著抑制HCT116细胞迁移及侵袭。Western Blotting实验显示姜黄素可增加E-cadherin蛋白表达水平，降低N-cadherin和Vimentin蛋白以及p-JAG1、p-Notch1、p-Notch2等蛋白的表达水平（均P<0.05）。结论：姜黄素可显著抑制结直肠癌HCT116细胞增殖、迁移、侵袭以及上皮间质转化，其机制可能与JAG1/Notch2通路失活有关。
关键词 姜黄素;结直肠癌;增殖;迁移;侵袭;上皮-间质转化
Effects and Mechanism of Curcumin on Cell Migration，Invasion，and Epithelial-Mesenchymal Transformation in Colorectal Cancer Cells
ZHANG Xiaomei1，ZHAO Yutao1，WANG Jumei1，ZHAO Shefen1，HAN Kunling1，LI Yanxia2，HAN Xue3，FAN Xiumin4
（1 Handan Central Hospital，Handan 056001，China; 2 Department of General Surgery，Affiliated Hospital of Hebei Engineering University，Handan 056002，China; 3 Department of Pharmacy，Hebei University of Chinese Medicine，Shijiazhuang 050200，China; 4 Department of Hematology，Handan First Hospital，Handan 056002，China）
Abstract Objective：To investigate the effects of curcumin on the proliferation，migration，invasion and epithelial mesenchymal transformation（EMT） of colorectal cancer cells.Methods：HCT116 cell lines of colorectal cancer were taken and randomly divided into a control group and an intervention group.HCT116 cells in intervention group were treated with curcumin 50 Ug/mL，and HCT116 cells in control group were treated with the same amount of dimethyl sulfoxide.The cell proliferation ability was detected by thiazolium blue（MTT） assay.Cell migration ability was detected by scratch healing assay.Cell invasion ability was detected by Transwell assay.Expression levels of epithelial cadherin（E-cadherin），neuronal cadherin（N-cadherin），Vimentin，p-Jagged 1（p-JAG1），p-Notch receptor 1（p-Notch 1），and p-Notch receptor 2（p-Notch2） were detected by Western Blotting.Results：Detection of MTT assay showed that curcumin could significantly inhibit the proliferation of HCT116 cells.Wounding healing assay and Transwell assay showed that curcumin could significantly inhibit HCT116 cell migration and invasion.Western Blotting experiments showed that curcumin could increase the expression level of E-cadherin protein，and decrease the expression levels of N-cadherin and Vimentin proteins，as well as p-JAG1，p-Notch1，p-Notch2 and other proteins（P<0.05）.Conclusion：Curcumin can significantly inhibit the proliferation，migration，invasion and epithelial mesenchymal transformation of colorectal cancer HCT116 cells，and the mechanism may be related to the inactivation of JAG1/Notch2 pathway. Keywords Curcumin; Colorectal cancer; Proliferation; Migration; Invasion; Epithelial-mesenchymal transformation
中图分类号：R284;R735.3文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.17.014
结直肠癌（Colorectal Cancer，CRC）是一种常见的恶性肿瘤，每年全世界CRC死亡病例超过60万，并且约25%的CRC患者在确诊时已经出现远处转移[1-2]。晚期CRC患者的预后较差，5年生存率不超过10%[3]。目前越来越多的研究证实某些中草药可用于肿瘤的治疗[4]。姜黄素是从中药姜黄中提取的一种有效活性成分，具有抗氧化、抗炎、清除自由基以及抗肿瘤等多种药理作用，常应用于心血管疾病以及消化系统疾病的治疗[5-6]。已有研究发现，姜黄素可抑制CRC致瘤性激酶PBK的活性，降低HCT116细胞的增殖水平，并诱导细胞凋亡[7]。然而，姜黄素对CRC细胞迁移、侵袭和上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal Transition，EMT）中的作用和具体机制尚不清楚。本研究旨在探讨姜黄素对HCT116细胞增殖、迁移、侵袭以及EMT相关蛋白表达的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株 结直肠癌细胞HCT116，购自美国模式培养物集存库。将细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37 ℃、5%CO2的环境中常规培养。
1.1.2 药物 姜黄素粉，含量≥99.5%，CAS号：458-37-7，分子量：368.38，规格100 mg（Sigma公司，美国，批号：78246）。
1.1.3 试剂与仪器 胎牛血清（Thermo Fisher Scientific公司，美国，货号：A3160901）;DMEM培养基（Thermo Fisher Scientific公司，美国，货号：0417）;二甲基亚砜（DMSO）（上海碧云天生物科技公司，批号：ST038-100）;噻唑蓝（MTT）试剂盒（Abcam公司，英国，货号：ab211091）;上皮性钙黏蛋白（E-cadherin）抗体（Abcam公司，英国，货号：ab244084）;神经性钙黏蛋白（N-cadherin）抗体（Abcam公司，英国，货号：256744）;波形蛋白（Vimentin）抗体（Abcam公司，英国，货号：8069）;Transwell室（Corning公司，美国，货号：3383）;磷酸化Jagged 1蛋白（p-JAG1）（Cell Signaling公司，美国，货号：70109S）;磷酸化Notch受体1蛋白（p-Notch1）（Cell Signaling公司，美国，货号：8216S）;磷酸化Notch受體2蛋白（p-Notch2）（Cell Signaling公司，美国，货号：4530S）;全自动凝胶成像和化学发光图像分析系统（Thermo Scientific公司，美国，ChemiDoc TMMP型）;酶标仪（BioTek公司，美国，synergy2型）;光学显微镜（Olympus公司，日本，IX70型）。
1.2 方法
1.2.1 分组与给药 将姜黄素粉末充分溶解于DMSO中，配成浓度为50 μg/mL的溶液。将细胞分为2组，观察组细胞使用50 μg/mL姜黄素处理;对照组细胞则使用等量DMSO处理。每组3个样本。
1.2.2 检测指标与方法
1.2.2.1 检测细胞增殖采用MTT实验[8] 以每孔1×104接种于96孔板中，在培养72 h后，每孔加入MTT溶液10 μL，培养4 h，弃上清，加入DMSO 100 μL，使用酶标仪在570 nm波长处检测光密度（Optical Density，OD）值。细胞成活率（%）=（观察组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100%。
1.2.2.2 检测细胞迁移采用划痕愈合实验[9] 将各组细胞接种于6孔板上培养，当细胞达到90%融合后，用200 μL微量移液器的吸管刮细胞层产生一条无细胞区域，测量此时划痕宽度，记为D 0 h。随后将细胞在无血清培养基中培养24 h后，测量划痕宽度，记为D 24 h。细胞迁移率（%）=（D 0 h-D 24 h）/D 0 h×100%
1.2.2.3 检测细胞侵袭采用Transwell实验[10] 将各组细胞悬浮液添加到Transwell上室，下室加入600 μL完全培养基，在37 ℃，5%CO2培养箱中培养24 h后，甲醛固定10 min，然后用1%结晶紫染色10 min，在显微镜下随机取5个视野的细胞并计数。
1.2.2.4 检测细胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、p-JAG1、p-Notch1以及p-Notch2表达水平采用Western Blotting实验[11] 将各组细胞在培养箱中培养48 h后，加入1%的蛋白酶抑制剂和RIPA裂解液提取蛋白，根据说明使用BCA蛋白试剂盒定量检测，使用10% SDS-PAGE凝胶电泳分离并转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，在室温下将膜浸泡在5%脱脂牛奶和TBST缓冲液中封闭2 h，随后将膜加入抗E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、p-JAG1、p-Notch1、p-Notch2抗体稀释液（1∶1 000），以GAPDH作为内参，并在4 ℃中孵育过夜，将膜加入羊抗兔二抗稀释液（1∶1 000）于37 ℃孵育2 h，ECL发光显影。
1.2.3 统计学方法 采用SPSS 25.0软件统计进行数据分析，所有实验重复3次。计量资料以均数±标准差（±s）表示，用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果
2.1 姜黄素对HCT116细胞增殖的影响
与对照组比较，观察组中24 h、48 h和72 h细胞成活率显著降低，差异有统计学意义（均P<0.05）。见表1。
2.2 姜黄素对HCT116细胞迁移能力的影响
对照组细胞迁移率（57.61±2.32）%，观察组细胞迁移率为（48.92±2.21）%，2组差异有统计学意义（P<0.01）。见图1。
2.3 姜黄素对HCT116细胞侵袭能力的影响
对照组细胞侵袭数（81.14±2.26）个，观察组细胞侵袭数为（54.28±2.72）个，差异有统计学意义（P<0.001）。见图2。
2.4 姜黄素对HCT116细胞EMT相关蛋白表达的影响
与对照组比较，观察组中E-cadherin蛋白的表达水平显著升高，N-cadherin蛋白、Vimentin蛋白表达水平显著降低，差异有统计学意义（均P<0.01）。见表2，图3。
2.5 姜黄素对HCT116细胞中JAG1/Notch2通路的影响
与对照组比较，观察组中p-JAG1蛋白、p-Notch1蛋白、p-Notch2蛋白表达水平均显著下降，差异均有统计学意义（均P<0.05）。见表3，图4。
3 讨论
目前在我国，结直肠癌已经位列恶性肿瘤发病第3位[12]。姜黄素是从中药姜黄、莪术等中药种提取的，具有抗肿瘤和抗氧化的功效[13-14]，可调节多种信号转导途径，已有研究证实其在体外细胞模型或动物模型中对肿瘤的预防和治疗具有重要作用，如在胃癌中，姜黄素可通过抑制Hsp90-JAK/STAT3信号通络的激活，显著降低胃癌细胞SGC-7901的增殖水平，并抑制细胞的迁移和侵袭[15-16]。当结直肠癌细胞发生EMT时，上皮细胞表型缺失，E-cadherin等蛋白表达减少，而N-cadherin、Vimentin等间质细胞的分子标志物表达增加，从而导致细胞间黏附能力下降甚至丧失[17-18]。已有相关研究报道，JAG1/Notch2信号通路与乳腺癌、CRC、肺癌等多种肿瘤的发生发展密切相关，当信号通路失调后可诱发肿瘤，属于致癌信号通路[19-20]。当JAG1/Notch2信号通路活化后，可通过磷酸化作用诱导下游靶基因表达和转录，从而导致JAG1、Notch1、Notch2蛋白的磷酸化水平增加[21-23]。本研究使用50 μg/mL姜黄素处理细胞，并进行细胞功能实验，结果说明姜黄素可通过下调JAG1/Notch2信号通路，抑制CRC细胞的增殖、迁移、侵袭以及EMT。
既往研究显示，姜黄素可通过靶向miR-491/PEG10抑制HCT116细胞的增殖，并促进细胞凋亡[24]。郑旦等[25]、胡艳红等[26]学者研究体外培养CRC细胞系SW480，并使用不同濃度的姜黄素进行处理，结果显示均可以显著降低细胞的增殖能力，其作用与时间及浓度相关。本研究结果与之相似。然而本研究仅限于体外细胞实验，后续将进行体内实验进一步证实此结论。
综上所述，本研究为结直肠癌的治疗提供了一个新靶点，同时有待进一步深究进而为直肠癌的防治提供理论依据。
参考文献
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[25]郑旦，高东萍，李岗.姜黄素对SW480细胞凋亡的影响及机制研究[J].中药材，2018，41（11）：2681-2684.
[26]胡艳红，黄秀榕，祁明信，等.姜黄素抑制人晶状体上皮细胞增殖与胶原蛋白合成的研究[J].中华中医药杂志，2011，26（9）：2103-2106.
（2021-07-06收稿 责任编辑：杨觉雄）
关键词 姜黄素;结直肠癌;增殖;迁移;侵袭;上皮-间质转化
Effects and Mechanism of Curcumin on Cell Migration，Invasion，and Epithelial-Mesenchymal Transformation in Colorectal Cancer Cells
ZHANG Xiaomei1，ZHAO Yutao1，WANG Jumei1，ZHAO Shefen1，HAN Kunling1，LI Yanxia2，HAN Xue3，FAN Xiumin4
（1 Handan Central Hospital，Handan 056001，China; 2 Department of General Surgery，Affiliated Hospital of Hebei Engineering University，Handan 056002，China; 3 Department of Pharmacy，Hebei University of Chinese Medicine，Shijiazhuang 050200，China; 4 Department of Hematology，Handan First Hospital，Handan 056002，China）
Abstract Objective：To investigate the effects of curcumin on the proliferation，migration，invasion and epithelial mesenchymal transformation（EMT） of colorectal cancer cells.Methods：HCT116 cell lines of colorectal cancer were taken and randomly divided into a control group and an intervention group.HCT116 cells in intervention group were treated with curcumin 50 Ug/mL，and HCT116 cells in control group were treated with the same amount of dimethyl sulfoxide.The cell proliferation ability was detected by thiazolium blue（MTT） assay.Cell migration ability was detected by scratch healing assay.Cell invasion ability was detected by Transwell assay.Expression levels of epithelial cadherin（E-cadherin），neuronal cadherin（N-cadherin），Vimentin，p-Jagged 1（p-JAG1），p-Notch receptor 1（p-Notch 1），and p-Notch receptor 2（p-Notch2） were detected by Western Blotting.Results：Detection of MTT assay showed that curcumin could significantly inhibit the proliferation of HCT116 cells.Wounding healing assay and Transwell assay showed that curcumin could significantly inhibit HCT116 cell migration and invasion.Western Blotting experiments showed that curcumin could increase the expression level of E-cadherin protein，and decrease the expression levels of N-cadherin and Vimentin proteins，as well as p-JAG1，p-Notch1，p-Notch2 and other proteins（P<0.05）.Conclusion：Curcumin can significantly inhibit the proliferation，migration，invasion and epithelial mesenchymal transformation of colorectal cancer HCT116 cells，and the mechanism may be related to the inactivation of JAG1/Notch2 pathway. Keywords Curcumin; Colorectal cancer; Proliferation; Migration; Invasion; Epithelial-mesenchymal transformation
中图分类号：R284;R735.3文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.17.014
结直肠癌（Colorectal Cancer，CRC）是一种常见的恶性肿瘤，每年全世界CRC死亡病例超过60万，并且约25%的CRC患者在确诊时已经出现远处转移[1-2]。晚期CRC患者的预后较差，5年生存率不超过10%[3]。目前越来越多的研究证实某些中草药可用于肿瘤的治疗[4]。姜黄素是从中药姜黄中提取的一种有效活性成分，具有抗氧化、抗炎、清除自由基以及抗肿瘤等多种药理作用，常应用于心血管疾病以及消化系统疾病的治疗[5-6]。已有研究发现，姜黄素可抑制CRC致瘤性激酶PBK的活性，降低HCT116细胞的增殖水平，并诱导细胞凋亡[7]。然而，姜黄素对CRC细胞迁移、侵袭和上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal Transition，EMT）中的作用和具体机制尚不清楚。本研究旨在探讨姜黄素对HCT116细胞增殖、迁移、侵袭以及EMT相关蛋白表达的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株 结直肠癌细胞HCT116，购自美国模式培养物集存库。将细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37 ℃、5%CO2的环境中常规培养。
1.1.2 药物 姜黄素粉，含量≥99.5%，CAS号：458-37-7，分子量：368.38，规格100 mg（Sigma公司，美国，批号：78246）。
1.1.3 试剂与仪器 胎牛血清（Thermo Fisher Scientific公司，美国，货号：A3160901）;DMEM培养基（Thermo Fisher Scientific公司，美国，货号：0417）;二甲基亚砜（DMSO）（上海碧云天生物科技公司，批号：ST038-100）;噻唑蓝（MTT）试剂盒（Abcam公司，英国，货号：ab211091）;上皮性钙黏蛋白（E-cadherin）抗体（Abcam公司，英国，货号：ab244084）;神经性钙黏蛋白（N-cadherin）抗体（Abcam公司，英国，货号：256744）;波形蛋白（Vimentin）抗体（Abcam公司，英国，货号：8069）;Transwell室（Corning公司，美国，货号：3383）;磷酸化Jagged 1蛋白（p-JAG1）（Cell Signaling公司，美国，货号：70109S）;磷酸化Notch受体1蛋白（p-Notch1）（Cell Signaling公司，美国，货号：8216S）;磷酸化Notch受體2蛋白（p-Notch2）（Cell Signaling公司，美国，货号：4530S）;全自动凝胶成像和化学发光图像分析系统（Thermo Scientific公司，美国，ChemiDoc TMMP型）;酶标仪（BioTek公司，美国，synergy2型）;光学显微镜（Olympus公司，日本，IX70型）。
1.2 方法
1.2.1 分组与给药 将姜黄素粉末充分溶解于DMSO中，配成浓度为50 μg/mL的溶液。将细胞分为2组，观察组细胞使用50 μg/mL姜黄素处理;对照组细胞则使用等量DMSO处理。每组3个样本。
1.2.2 检测指标与方法
1.2.2.1 检测细胞增殖采用MTT实验[8] 以每孔1×104接种于96孔板中，在培养72 h后，每孔加入MTT溶液10 μL，培养4 h，弃上清，加入DMSO 100 μL，使用酶标仪在570 nm波长处检测光密度（Optical Density，OD）值。细胞成活率（%）=（观察组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100%。
1.2.2.2 检测细胞迁移采用划痕愈合实验[9] 将各组细胞接种于6孔板上培养，当细胞达到90%融合后，用200 μL微量移液器的吸管刮细胞层产生一条无细胞区域，测量此时划痕宽度，记为D 0 h。随后将细胞在无血清培养基中培养24 h后，测量划痕宽度，记为D 24 h。细胞迁移率（%）=（D 0 h-D 24 h）/D 0 h×100%
1.2.2.3 检测细胞侵袭采用Transwell实验[10] 将各组细胞悬浮液添加到Transwell上室，下室加入600 μL完全培养基，在37 ℃，5%CO2培养箱中培养24 h后，甲醛固定10 min，然后用1%结晶紫染色10 min，在显微镜下随机取5个视野的细胞并计数。
1.2.2.4 检测细胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、p-JAG1、p-Notch1以及p-Notch2表达水平采用Western Blotting实验[11] 将各组细胞在培养箱中培养48 h后，加入1%的蛋白酶抑制剂和RIPA裂解液提取蛋白，根据说明使用BCA蛋白试剂盒定量检测，使用10% SDS-PAGE凝胶电泳分离并转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，在室温下将膜浸泡在5%脱脂牛奶和TBST缓冲液中封闭2 h，随后将膜加入抗E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、p-JAG1、p-Notch1、p-Notch2抗体稀释液（1∶1 000），以GAPDH作为内参，并在4 ℃中孵育过夜，将膜加入羊抗兔二抗稀释液（1∶1 000）于37 ℃孵育2 h，ECL发光显影。
1.2.3 统计学方法 采用SPSS 25.0软件统计进行数据分析，所有实验重复3次。计量资料以均数±标准差（±s）表示，用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果
2.1 姜黄素对HCT116细胞增殖的影响
与对照组比较，观察组中24 h、48 h和72 h细胞成活率显著降低，差异有统计学意义（均P<0.05）。见表1。
2.2 姜黄素对HCT116细胞迁移能力的影响
对照组细胞迁移率（57.61±2.32）%，观察组细胞迁移率为（48.92±2.21）%，2组差异有统计学意义（P<0.01）。见图1。
2.3 姜黄素对HCT116细胞侵袭能力的影响
对照组细胞侵袭数（81.14±2.26）个，观察组细胞侵袭数为（54.28±2.72）个，差异有统计学意义（P<0.001）。见图2。
2.4 姜黄素对HCT116细胞EMT相关蛋白表达的影响
与对照组比较，观察组中E-cadherin蛋白的表达水平显著升高，N-cadherin蛋白、Vimentin蛋白表达水平显著降低，差异有统计学意义（均P<0.01）。见表2，图3。
2.5 姜黄素对HCT116细胞中JAG1/Notch2通路的影响
与对照组比较，观察组中p-JAG1蛋白、p-Notch1蛋白、p-Notch2蛋白表达水平均显著下降，差异均有统计学意义（均P<0.05）。见表3，图4。
3 讨论
目前在我国，结直肠癌已经位列恶性肿瘤发病第3位[12]。姜黄素是从中药姜黄、莪术等中药种提取的，具有抗肿瘤和抗氧化的功效[13-14]，可调节多种信号转导途径，已有研究证实其在体外细胞模型或动物模型中对肿瘤的预防和治疗具有重要作用，如在胃癌中，姜黄素可通过抑制Hsp90-JAK/STAT3信号通络的激活，显著降低胃癌细胞SGC-7901的增殖水平，并抑制细胞的迁移和侵袭[15-16]。当结直肠癌细胞发生EMT时，上皮细胞表型缺失，E-cadherin等蛋白表达减少，而N-cadherin、Vimentin等间质细胞的分子标志物表达增加，从而导致细胞间黏附能力下降甚至丧失[17-18]。已有相关研究报道，JAG1/Notch2信号通路与乳腺癌、CRC、肺癌等多种肿瘤的发生发展密切相关，当信号通路失调后可诱发肿瘤，属于致癌信号通路[19-20]。当JAG1/Notch2信号通路活化后，可通过磷酸化作用诱导下游靶基因表达和转录，从而导致JAG1、Notch1、Notch2蛋白的磷酸化水平增加[21-23]。本研究使用50 μg/mL姜黄素处理细胞，并进行细胞功能实验，结果说明姜黄素可通过下调JAG1/Notch2信号通路，抑制CRC细胞的增殖、迁移、侵袭以及EMT。
既往研究显示，姜黄素可通过靶向miR-491/PEG10抑制HCT116细胞的增殖，并促进细胞凋亡[24]。郑旦等[25]、胡艳红等[26]学者研究体外培养CRC细胞系SW480，并使用不同濃度的姜黄素进行处理，结果显示均可以显著降低细胞的增殖能力，其作用与时间及浓度相关。本研究结果与之相似。然而本研究仅限于体外细胞实验，后续将进行体内实验进一步证实此结论。
综上所述，本研究为结直肠癌的治疗提供了一个新靶点，同时有待进一步深究进而为直肠癌的防治提供理论依据。
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（2021-07-06收稿 责任编辑：杨觉雄）