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[摘要]目的 探讨血清Livin联合Survivin检测在视网膜母细胞瘤诊断的应用价值。方法 采用酶联免疫吸附试验定量测定40例RB患者和40例非恶性眼病患者的血清Livin、Survivin含量。结果 RB患者的血清Livin、Survivin水平较非恶性眼病患者有统计学意义（P<0.05）。血清Livin、Survivin水平与RB患者的癌组织分化程度和临床分期显著相关。血清Livin的最优截断点为182.5ng/L，敏感度和特异度分别为80.0%和70.0%；血清Survivin的最优截断点为14.5ng/L，敏感度和特异度分别为87.5%和75.0%；当两者联合时，可将敏感度提高至92.5%。结论 血清Livin、Survivin在视网膜母细胞瘤患者中均表达显著上升，联合检测血清Livin、Survivin水平可提高视网膜母细胞瘤的诊断价值。
[关键词]视网膜母细胞瘤；Livin；Survivin；血清；诊断价值
[中图分类号]R739.7 [文献标识码]B [文章编号]2095-0616（2016）11-144-04
视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，RB）旧称“视神经胶质瘤”，是原发于视网膜内颗粒层的胚胎性恶性肿瘤，是儿童最常见的眼内恶性肿瘤，可侵犯单眼或双眼，恶性程度高，预后较差，对患儿的视力和生命均造成严重影响和威胁。因此，早发现、早诊断，以便进行及时有效的治疗，是提高治愈率和改善预后的关键。Livin是最新发现的一个凋亡抑制蛋白家族（inhibitors of apoptosis protein，IAPs）的成员，在大多数肿瘤中高表达，被认为与肿瘤的发生、发展及预后有重要关联。Survivin是迄今发现的最强大的凋亡抑制因子，兼有调节细胞周期和抑制细胞凋亡的双重作用，与肿瘤细胞生长失控、侵袭迁移的能力密切相关。本研究通过检测RB患者血清中Livin、Survivin的含量，探讨两者在RB患者中表达和诊断的意义，现报道如下。
1资料与方法
1.1一般资料
选取2012年1月～2015年10月我院收治的40例RB患者作为研究对象。所有患者均经病理检查确诊，其中男22例，女18例，年龄7～63个月，平均（25.0±13.5）个月，按照鲜军舫的临床分期分为四期，其中1期（眼球内期）16例，2期（青光眼期）9例，3期（眼球外期）14例，4期（远处转移期）1例；按组织病理学分型，未分化型24例，分化型16例。另外选取同期在本院诊断为斜视、先天性白内障或眼部外伤等非恶性眼病，并且各项实验室检查指标均正常的40例儿童作为对照，其中男24例，女16例，年龄8～70个月，平均（27.1±14.5）个月。两组患者均未接受任何治疗，均签署知情同意书。
1.2检测方法
所有研究对象和健康志愿者均清晨空腹抽取外周静脉血5mL，置于未加抗凝剂的无菌试管中，30min内3000r/min全血离心10min，抽取上层清液分装，放置在20℃冰箱中保存，待分批检测。Livin、Survivin均采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定，试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。操作过程严格按照说明书进行，每个血清样本行正、副2个测试孔，最后取其平均值。
1.3统计学方法
采用SPSS17.0统计学软件进行数据处理和分析。计量资料采用（x±s）表示，组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。应用ROC曲线确定最佳截断点，同时计算ROC曲线下面积（AUROC），判断最优截断点的灵敏度和特异度。
2结果
2.1两组患者血清Livin、Survivin表达的比较
所有血清样本中均可检测到Livin和Survivin的含量。RB患者的血清Livin和Survivin的含量分别为（394.08±219.587）ng/L和（25.25±9.27）ng/L，均显著高于对照组的（161.68±110.27）ng/L和（13.88±6.72）ng/L，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
2.2血清Livin、Survivin水平与RB患者临床特征的关系
在不同临床分期的RB患者比较上，3～4期患者的血清Livin、Survivin表达水平显著高于1-2期的患者，差异有统计学意义（P<0.05）；在不同癌组织分化程度的RB患者比较上，分化的患者的血清Livin、Survivin表达水平显著高于未分化的患者，差异有统计学意义（P<0.05）。但在不同性别和年龄的RB组比较上，男和女、>2岁和≤2岁RB组的血清Livin、Survivin表达水平无统计学意义（P>0.05）。见表2。
2.3血清Livin、Survivin水平的ROC线面积和最优截断点
以血清Livin和Survivin水平分别绘制ROC曲线。以182.5ng/L作为截断值时，血清Livin诊断RB的灵敏度和特异度最高，分别为80.0%和70.0%，ROC曲线下面积为0.832，95%置信区间为0.746～0.918；以14.5ng/L作为截断值时，血清Survivin诊断RB的灵敏度和特异度最高，分别为87.5%和75.0%，ROC曲线下面积为0.847，95%置信区间为0.762～0.931；当两者联合时，只要其中1项为阳性者即为联合检查阳性，可将诊断RB的敏感度提高到92.5%，但特异度降低到65.0%。见图1。
3讨论
RB是婴幼儿最常见的原发性眼内恶性肿瘤，在发达国家，眼内期RB早期诊断和治疗后10年生存率可达80%以上，并且通过保守治疗来保留眼球和有用视力并不影响生存率。但在发展中国家，许多RB患者确诊时已处于眼外期，眼球保存率和生存率往往低于发达国家。因此，早期诊断和尽早治疗是关键。恶性肿瘤的形成是一个多阶段、多基因调控的复杂过程，肿瘤细胞的生长繁殖不仅与癌基因的激活和抑癌基因的突变或缺失有关，还必须逃避各种因素所引起的细胞凋亡。凋亡抑制是肿瘤细胞的一个重要特性，与肿瘤细胞的无限增殖有密切关联。细胞凋亡是由基因调控的细胞自主性死亡过程，对机体的生长发育、免疫记忆、内环境稳定等有重要作用。近年来多项研究表明，细胞凋亡调控的正常与否与RB的发生、发展和转归都有密切的关系，诱导RB细胞凋亡可达到治愈RB的目的。 IAPs是一类在分子结构上具有高度同源性和细胞内源性，能抑制细胞凋亡的蛋白家族，也是目前发现的唯一可以与半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶（Caspase）直接结合而起抑制作用的蛋白家族，通过参与肿瘤坏死因子（TNF-α）介导的信号传递机制，最后与核转录因子（NF-κB）相互作用而发挥抗细胞凋亡的作用。目前已发现的IAP家族有8个成员，其中Livin和Survivin作为新近发现抗凋亡作用最强的成员，两者均可通过多种信号途径，调控细胞周期，抑制细胞凋亡。Livin的BIR结构可通过与多种Caspase结合，降低Caspase活性，抑制级联反应中Caspase间的相互作用和核酸的裂解，从而起到抑制凋亡的作用。Survivin在IAPs家族中分子量为最小，不仅能够抑制细胞凋亡，调控细胞周期，还具有促进细胞分化和促进血管生成的作用。由于这两种因子的表达具有高度组织特异性，即在正常成人组织中不表达，在胚胎和胎儿组织中强烈表达，在成熟的终末分化组织中不表达，但在多种转化细胞和人类几乎所有恶性肿瘤组织中高表达，因此可作为肿瘤诊断的指标之一。
本研究中，RB患者血清中Livin和Survivin的含量均高于非恶性眼病患者，我们推测高表达的Livin和Survivin可能通过某种信号通路抑制癌细胞的凋亡，从而使肿瘤细胞逃避了凋亡进程，同时也进一步说明了Livin和Survivin在RB的侵袭和进展中扮演重要的角色。此外，有多篇文献报道了Livin和Survivin表达与恶性肿瘤的预后呈正相关，包括胃癌、骨肉瘤、肠癌等。但目前尚无有关Livin和Survivin表达与RB预后的报道，本研究发现，RB患者血清Livin和Survivin含量与癌组织分化程度和临床分期密切相关，主要表现为癌组织分化越差，临床分期越高，血清Livin和Survivin含量越高，提示Livin和Survivin的检测可作为判断RB患者疗效及预后的指标之一。该结果与孙燕的结果相同，但与孔虹和张萌的报道不尽相同，说明Livin和Survivin在RB中具体机制尚未明确，这也是本领域接下来的主要研究方向。
本研究利用ROC曲线对血清Livin和Survivin诊断RB的价值进行评估。血清Livin以182.5ng/L作为截断值时，灵敏度和特异度最高，分别为80.0%和70.0%；血清Survivin以14.5ng/L作为截断值时，灵敏度和特异度分别为87.5%和75.0%，略低于孔虹的研究结果。单独检测时，两者均不能达到较高诊断效能。肿瘤标志物单项检测时难免会出现一定的漏诊率，联合检测可弥补这一缺陷。当两者结合时，其诊断RB的敏感度可提高至92.5%，提示联合检测血清Livin和Survivin对于RB诊断具有很好的互补作用，从而提高了RB的检出率和诊断RB的准确性，具有更好的临床应用价值。
综上所述，RB患者血清中的Livin和Survivin表达显著上升，因此，可以通过检测这两种标志物对RB进行早期诊断。当联合检测血清Livin和Survivin含量时，可显著提高RB的诊断价值。
[关键词]视网膜母细胞瘤；Livin；Survivin；血清；诊断价值
[中图分类号]R739.7 [文献标识码]B [文章编号]2095-0616（2016）11-144-04
视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，RB）旧称“视神经胶质瘤”，是原发于视网膜内颗粒层的胚胎性恶性肿瘤，是儿童最常见的眼内恶性肿瘤，可侵犯单眼或双眼，恶性程度高，预后较差，对患儿的视力和生命均造成严重影响和威胁。因此，早发现、早诊断，以便进行及时有效的治疗，是提高治愈率和改善预后的关键。Livin是最新发现的一个凋亡抑制蛋白家族（inhibitors of apoptosis protein，IAPs）的成员，在大多数肿瘤中高表达，被认为与肿瘤的发生、发展及预后有重要关联。Survivin是迄今发现的最强大的凋亡抑制因子，兼有调节细胞周期和抑制细胞凋亡的双重作用，与肿瘤细胞生长失控、侵袭迁移的能力密切相关。本研究通过检测RB患者血清中Livin、Survivin的含量，探讨两者在RB患者中表达和诊断的意义，现报道如下。
1资料与方法
1.1一般资料
选取2012年1月～2015年10月我院收治的40例RB患者作为研究对象。所有患者均经病理检查确诊，其中男22例，女18例，年龄7～63个月，平均（25.0±13.5）个月，按照鲜军舫的临床分期分为四期，其中1期（眼球内期）16例，2期（青光眼期）9例，3期（眼球外期）14例，4期（远处转移期）1例；按组织病理学分型，未分化型24例，分化型16例。另外选取同期在本院诊断为斜视、先天性白内障或眼部外伤等非恶性眼病，并且各项实验室检查指标均正常的40例儿童作为对照，其中男24例，女16例，年龄8～70个月，平均（27.1±14.5）个月。两组患者均未接受任何治疗，均签署知情同意书。
1.2检测方法
所有研究对象和健康志愿者均清晨空腹抽取外周静脉血5mL，置于未加抗凝剂的无菌试管中，30min内3000r/min全血离心10min，抽取上层清液分装，放置在20℃冰箱中保存，待分批检测。Livin、Survivin均采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定，试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。操作过程严格按照说明书进行，每个血清样本行正、副2个测试孔，最后取其平均值。
1.3统计学方法
采用SPSS17.0统计学软件进行数据处理和分析。计量资料采用（x±s）表示，组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。应用ROC曲线确定最佳截断点，同时计算ROC曲线下面积（AUROC），判断最优截断点的灵敏度和特异度。
2结果
2.1两组患者血清Livin、Survivin表达的比较
所有血清样本中均可检测到Livin和Survivin的含量。RB患者的血清Livin和Survivin的含量分别为（394.08±219.587）ng/L和（25.25±9.27）ng/L，均显著高于对照组的（161.68±110.27）ng/L和（13.88±6.72）ng/L，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
2.2血清Livin、Survivin水平与RB患者临床特征的关系
在不同临床分期的RB患者比较上，3～4期患者的血清Livin、Survivin表达水平显著高于1-2期的患者，差异有统计学意义（P<0.05）；在不同癌组织分化程度的RB患者比较上，分化的患者的血清Livin、Survivin表达水平显著高于未分化的患者，差异有统计学意义（P<0.05）。但在不同性别和年龄的RB组比较上，男和女、>2岁和≤2岁RB组的血清Livin、Survivin表达水平无统计学意义（P>0.05）。见表2。
2.3血清Livin、Survivin水平的ROC线面积和最优截断点
以血清Livin和Survivin水平分别绘制ROC曲线。以182.5ng/L作为截断值时，血清Livin诊断RB的灵敏度和特异度最高，分别为80.0%和70.0%，ROC曲线下面积为0.832，95%置信区间为0.746～0.918；以14.5ng/L作为截断值时，血清Survivin诊断RB的灵敏度和特异度最高，分别为87.5%和75.0%，ROC曲线下面积为0.847，95%置信区间为0.762～0.931；当两者联合时，只要其中1项为阳性者即为联合检查阳性，可将诊断RB的敏感度提高到92.5%，但特异度降低到65.0%。见图1。
3讨论
RB是婴幼儿最常见的原发性眼内恶性肿瘤，在发达国家，眼内期RB早期诊断和治疗后10年生存率可达80%以上，并且通过保守治疗来保留眼球和有用视力并不影响生存率。但在发展中国家，许多RB患者确诊时已处于眼外期，眼球保存率和生存率往往低于发达国家。因此，早期诊断和尽早治疗是关键。恶性肿瘤的形成是一个多阶段、多基因调控的复杂过程，肿瘤细胞的生长繁殖不仅与癌基因的激活和抑癌基因的突变或缺失有关，还必须逃避各种因素所引起的细胞凋亡。凋亡抑制是肿瘤细胞的一个重要特性，与肿瘤细胞的无限增殖有密切关联。细胞凋亡是由基因调控的细胞自主性死亡过程，对机体的生长发育、免疫记忆、内环境稳定等有重要作用。近年来多项研究表明，细胞凋亡调控的正常与否与RB的发生、发展和转归都有密切的关系，诱导RB细胞凋亡可达到治愈RB的目的。 IAPs是一类在分子结构上具有高度同源性和细胞内源性，能抑制细胞凋亡的蛋白家族，也是目前发现的唯一可以与半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶（Caspase）直接结合而起抑制作用的蛋白家族，通过参与肿瘤坏死因子（TNF-α）介导的信号传递机制，最后与核转录因子（NF-κB）相互作用而发挥抗细胞凋亡的作用。目前已发现的IAP家族有8个成员，其中Livin和Survivin作为新近发现抗凋亡作用最强的成员，两者均可通过多种信号途径，调控细胞周期，抑制细胞凋亡。Livin的BIR结构可通过与多种Caspase结合，降低Caspase活性，抑制级联反应中Caspase间的相互作用和核酸的裂解，从而起到抑制凋亡的作用。Survivin在IAPs家族中分子量为最小，不仅能够抑制细胞凋亡，调控细胞周期，还具有促进细胞分化和促进血管生成的作用。由于这两种因子的表达具有高度组织特异性，即在正常成人组织中不表达，在胚胎和胎儿组织中强烈表达，在成熟的终末分化组织中不表达，但在多种转化细胞和人类几乎所有恶性肿瘤组织中高表达，因此可作为肿瘤诊断的指标之一。
本研究中，RB患者血清中Livin和Survivin的含量均高于非恶性眼病患者，我们推测高表达的Livin和Survivin可能通过某种信号通路抑制癌细胞的凋亡，从而使肿瘤细胞逃避了凋亡进程，同时也进一步说明了Livin和Survivin在RB的侵袭和进展中扮演重要的角色。此外，有多篇文献报道了Livin和Survivin表达与恶性肿瘤的预后呈正相关，包括胃癌、骨肉瘤、肠癌等。但目前尚无有关Livin和Survivin表达与RB预后的报道，本研究发现，RB患者血清Livin和Survivin含量与癌组织分化程度和临床分期密切相关，主要表现为癌组织分化越差，临床分期越高，血清Livin和Survivin含量越高，提示Livin和Survivin的检测可作为判断RB患者疗效及预后的指标之一。该结果与孙燕的结果相同，但与孔虹和张萌的报道不尽相同，说明Livin和Survivin在RB中具体机制尚未明确，这也是本领域接下来的主要研究方向。
本研究利用ROC曲线对血清Livin和Survivin诊断RB的价值进行评估。血清Livin以182.5ng/L作为截断值时，灵敏度和特异度最高，分别为80.0%和70.0%；血清Survivin以14.5ng/L作为截断值时，灵敏度和特异度分别为87.5%和75.0%，略低于孔虹的研究结果。单独检测时，两者均不能达到较高诊断效能。肿瘤标志物单项检测时难免会出现一定的漏诊率，联合检测可弥补这一缺陷。当两者结合时，其诊断RB的敏感度可提高至92.5%，提示联合检测血清Livin和Survivin对于RB诊断具有很好的互补作用，从而提高了RB的检出率和诊断RB的准确性，具有更好的临床应用价值。
综上所述，RB患者血清中的Livin和Survivin表达显著上升，因此，可以通过检测这两种标志物对RB进行早期诊断。当联合检测血清Livin和Survivin含量时，可显著提高RB的诊断价值。