【摘 要】
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β-葡萄糖苷酶是纤维素分解酶系中的重要组成部分,为从嗜热微生物中挖掘酶学性质优良的新型β-葡萄糖苷酶,解决β-葡萄糖苷酶在工业应用方面普遍存在的活力偏低、稳定性不足、易受产物抑制等问题,通过密码子优化、基因合成和分子克隆技术,从热解糖高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)基因组中挖掘新型β-葡萄糖苷酶基因bglY,构建重组表达载体pET22b-bglY,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导获得可溶性表达,采用Ni-NTA亲和层
【机 构】
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滁州学院生物与食品工程学院 滁州 239000;安徽大学现代生物制造协同创新中心 合肥230601;滁州学院生物与食品工程学院 滁州 239000;安徽大学现代生物制造协同创新中心 合肥230601
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β-葡萄糖苷酶是纤维素分解酶系中的重要组成部分,为从嗜热微生物中挖掘酶学性质优良的新型β-葡萄糖苷酶,解决β-葡萄糖苷酶在工业应用方面普遍存在的活力偏低、稳定性不足、易受产物抑制等问题,通过密码子优化、基因合成和分子克隆技术,从热解糖高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)基因组中挖掘新型β-葡萄糖苷酶基因bglY,构建重组表达载体pET22b-bglY,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导获得可溶性表达,采用Ni-NTA亲和层析法获得纯酶,并探究其酶学性质.结果显示,BglY属于GH1家族成员,分子量为52×103,最适反应温度65℃,70℃的半衰期达1 h;最适反应pH 6.5,在pH 5-10范围内稳定;p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside(pNPG)为底物时比活为420.2±5.6 U/mg,米氏常数Km值和最大反应速率Vmax分别为2.1±0.4 mmol/L和909.1±6.2 μmol min-1 mg-1;该酶对β-1,4糖苷键的底物具有水解偏好性,也可以水解纤维二糖和乳糖;5 mmol/L Fe3+、Fe2+、Cr2+、Ca2+、Mn2+和EDTA对酶有激活作用,1％SDS完全抑制其活性;该酶可以抵抗产物葡萄糖的反馈抑制,且0.1-0.6 mol/L浓度的葡萄糖对酶具有激活作用,其中0.4 mol/L葡萄糖可提升活性至1.3倍,当葡萄糖浓度超过0.6 mol/L时,酶的活性才开始出现抑制.本研究表明BglY是一个葡萄糖激活型β-葡萄糖苷酶,其酶学性质优异,反应pH和温度范围较广且稳定,同时能水解天然底物纤维二糖和乳糖,可在提高纤维素生物质向葡萄糖的酶促转化等方面发挥应用潜力.
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