论文部分内容阅读
【摘 要】 目的：研究黄精对环磷酰胺的增效减毒作用。方法：将肉瘤S180细胞复苏，用生理盐水稀释后接种于小鼠腹腔内行细胞传代培养。7天后于无菌条件下抽取腹水，调配成浓度为1.75×107个瘤细胞/mL的细胞悬液，对40只小鼠进行肿瘤接种造模，每鼠接种0.2 mL于右腋窝下。接种24 h后称重，编号，随机将40只小鼠分为4组，分别为荷瘤组、CTX组、CTX+中剂量黄精组、CTX+高剂量黄精组。造模次日开始给药，共11天，停药次日处死，观察各组小鼠的一般状况，计算抑瘤率，脾、肾、胸腺指数。结果：黄精联合使用CTX对S180荷瘤小鼠的抑瘤率明显高于单独使用，黄精可减轻CTX对荷瘤小鼠免疫器官的毒性作用，保护荷瘤小鼠脾脏和胸腺并促其生长。结论：黄精与环磷酰胺联合用药具有增效减毒作用。
【关键词】 黄精 环磷酰胺 增效减毒
【中图分类号】 R931 【文献标识码】 A 【文章编号】 1671-5160（2014）09-0394-02
黄精（Rhizoma polygonati）是临床常用中药材，其味甘、性平，入脾、肾、肺经，具有补气养阴，健脾，润肺，益肾的功效[1]。Wang和Cai等[2-3]首次从黄精中分离得到一种甾体皂苷，并发现其在体外试验中对肿瘤细胞有明显的抑制作用，大量体内外实验[4-5]表明黄精多糖对小鼠H22实体瘤、S180腹水瘤的生长和增殖有显著抑制作用。张峰等[6]研究黄精多糖对H22实体瘤的生长抑制作用和对荷瘤小鼠免疫调节作用，结果发现抑瘤率最高达56.25%。现代药理学研究表明黄精具有抗肿瘤、调节免疫、保护器官、抗氧化等作用[7]。
本研究通过建立S180荷瘤小鼠模型，观察不同剂量的黄精水提液对环磷酰胺化疗荷瘤小鼠的生活状况，抑瘤率，胸腺、脾脏指的变化，来探讨黄精对抗肿瘤药物的增效减毒作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物
清洁级昆明小鼠，7-9周龄，雌雄各半，体重15-24g，购自河北医科大学实验动物中心（合格证号：1003008）。动物在实验前适应性驯养1周。
1.2 瘤株
小鼠S180腹水株由河北大学药学院传代保存。
1.3 黄精水提物的制备
称取黄精（由河北大学附属医院中药房提供，所有药品均经中药专家鉴定）40 g，蒸馏水浸泡2 h后，分別加8倍量、6倍量、4倍量的水煎煮3次，时间分别为药液熬开后60 min、40 min、30 min，将三次煎煮的药液混合，离心，取上清，用旋转蒸发仪低温浓缩至每毫升相当于原生药材1 g的浓度，即得黄精水提取物，即为高剂量的中药（1 g/mL），中剂量的中药加蒸馏水稀释一倍即可。水提物置4℃低温保存备用。
1.4 注射用环磷酰胺腹腔注射液的配制
购自河北大学附属医院，由山西普德药业有限公司生产（批号：20090903），0.2 g/支，临用前以生理盐水倍比稀释至2 mg/mL，放置4℃冰箱避光保存。
1.5 仪器
超级恒温水浴（山东鄄城华鲁仪器有限公司，型号：HH-601）
电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司，型号：AE240）
超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司， 型号：SW-CJ-2FD）
可见分光光度计（精华科技仪器有限公司 ，型号：722）
倒置显微镜（南京江南永新光学有限公司）
台式低速离心机（北京京立离心机有限公司，型号：LD4-1.8）
1.6 S180瘤源小鼠的复制
将冻存的S180细胞取出，置37℃水浴锅中使融化，以生理盐水洗涤一次，然后低速离心，弃上清液，再用生理盐水稀释后，取0.5 mL注入小鼠腹腔内。
1.7 肿瘤接种造模
S180细胞培养7天后，选择精神状态好，腹水饱满的小鼠断颈处死，于无菌条件下消毒鼠腹，抽取癌性腹水，按1：3比例用生理盐水稀释，吹吸均匀，再以3000转离心5 min，弃上清液，再加入生理盐水调配成浓度为1.75×107个瘤细胞/mL的细胞悬液。每鼠接种0.2 mL（约含3.5×106个瘤细胞）于右腋窝下。
1.8 实验动物分组
小鼠接种瘤细胞24 h后，称重、编号，按巡回顺序法随机分4组，每组10只，各组小鼠用3%苦味酸标记，自由摄取饲料，量不限，自由饮用蒸馏水。
1.9 实验动物的给药方法
① 荷瘤组：生理盐水0.4 mL灌胃，同时约5小时后腹腔注射生理盐水0.2 mL ，1天1次，共11天；② CTX组：生理盐水0.4 mL灌胃，同时5小时后腹腔注射CTX 0.1 mL/10g（20 mg/kg）， l天1次，共11天；③ 黄精中剂量组：中剂量（10 g/kg） 黄精0.2 mL/10 g灌胃，同时约5小时后腹腔注射CTX0.1 mL/10 g（20 mg/kg）， l天1次，共11天；④ 黄精高剂量组：高剂量（20 g/kg）黄精0.2 mL/10 g灌胃，同时约5小时后腹腔注射CTX0.1 mL/10 g（20 mg/kg），l天1次，共11天。
1.10 检测指标及其方法
1.10.1 瘤重和抑瘤率
在第12天，将小鼠眼球摘除取血后断颈处死，依次用碘酊酒精消毒操作部位皮肤，于超净工作台上，以无菌操作从腋部皮下完整剥取肿瘤组织，剥离干净后于电子天平称瘤体质量并计算抑瘤率。
肿瘤抑制率（%）=（荷瘤组平均瘤重-各给药组平均瘤重）/荷瘤组平均瘤重
1.10.2 肝、肾、脾、胸腺指数的测定
剥离其肝 、肾 、脾 、胸腺，用电子分析天平称重，按公式计算各脏器指数。 脏器指数=脏器重（mg）/鼠重（g）
1.11 统计方法
各组数据以均数±标准差（ ）表示，采用SPSS统计软件进行分析，多组间比较用One-Way ANOVA方差分析。
2 实验结果
2.1 黄精对化疗小鼠肿瘤生长的影响
如表1所示：与荷瘤组相比，各给药组的瘤重均显著下降，具有统计学意义 （P<0.01），与CTX组相比，黄精高、中剂量组抑瘤率均大于CTX组，且黄精高剂量组的瘤重差异具有显著性（P<0.05）。
表1 各组荷瘤小鼠瘤重与抑瘤率的比较（ ）
注：与荷瘤组相比，** P<0.01；与CTX组相比，#P<0.05。
2.2 黄精对化疗小鼠免疫器官的影响
由表2可见：与荷瘤组相比，单用CTX组和联合用黄精高中剂量组的胸腺指数和脾脏指数均有统计学差异（P <0.05，P <0.01），与CTX组相比，黄精高、中剂量组胸腺指数和脾脏指数均显著升高，差异有显著性（P<0.01，P<0.05）。
表2 黄精对化疗小鼠免疫器官重量的影响（ ）
注：与荷瘤组相比，** P<0.01，* P<0.05；与CTX组相比，# P<0.05，## P<0.01。
4 讨论
肿瘤能抑制机体的免疫功能，而化疗药物可加重机体的免疫抑制[8-9]。目前临床常用的化疗药物多数可损伤机体的免疫系统，胸腺、脾脏指数从免疫器官发育的角度反映了机体的免疫能力，可作为评价药物对机体免疫功能影响的指标。本实验结果显示，与荷瘤组相比，CTX组小鼠的胸腺指数和脾脏指数均显著降低，表明CTX可致免疫器官萎缩，对小鼠的免疫功能具有抑制作用。与CTX组相比，黄精高、中剂量组胸腺指数和脾脏指数均显著升高，表明黄精对CTX所致的免疫器官的萎缩具有一定的保护作用。
5 结论
综上所述，黄精与环磷酰胺合用对治疗肿瘤具有协同抑制作用，黄精可抑制荷瘤小鼠的移植性肿瘤的生长，与化疗药物环磷酰胺联合抗肿瘤具有增效作用，可减轻CTX对化疗小鼠免疫器官的毒性作用，保护荷瘤小鼠的脾脏和胸腺并促进其生长，这为黄精应用于临床或作为化疗后辅助用药提供了一定实验依据。
参考文献
[1]国家药典委员会. 中华人民共和国药典2010年版（一部）. 北京： 中国医药科技出版社， 2010： 288.
[2]江华. 黄精多糖的抗肿瘤活性研究[J]. 南京中医药大学学报， 2010， 26（6）：479～480.
[3]叶红翠， 张小平， 余红， 等. 多花黄精粗多糖抗肿瘤活性研究[J].中国实验方剂学杂志， 2008， 14（6）：34～36.
[4]张峰，高群，孔令雷，等. 黄精多糖抗肿瘤作用的实验研究[J]. 中国实用医药杂志，2007，2（21）：95～96.
[5]陸建平， 张静， 张艳贞. 黄精多糖的功能活性及应用前景[J]. 食品安全质量检测学报， 2013， 4（1）： 273～278.
【关键词】 黄精 环磷酰胺 增效减毒
【中图分类号】 R931 【文献标识码】 A 【文章编号】 1671-5160（2014）09-0394-02
黄精（Rhizoma polygonati）是临床常用中药材，其味甘、性平，入脾、肾、肺经，具有补气养阴，健脾，润肺，益肾的功效[1]。Wang和Cai等[2-3]首次从黄精中分离得到一种甾体皂苷，并发现其在体外试验中对肿瘤细胞有明显的抑制作用，大量体内外实验[4-5]表明黄精多糖对小鼠H22实体瘤、S180腹水瘤的生长和增殖有显著抑制作用。张峰等[6]研究黄精多糖对H22实体瘤的生长抑制作用和对荷瘤小鼠免疫调节作用，结果发现抑瘤率最高达56.25%。现代药理学研究表明黄精具有抗肿瘤、调节免疫、保护器官、抗氧化等作用[7]。
本研究通过建立S180荷瘤小鼠模型，观察不同剂量的黄精水提液对环磷酰胺化疗荷瘤小鼠的生活状况，抑瘤率，胸腺、脾脏指的变化，来探讨黄精对抗肿瘤药物的增效减毒作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物
清洁级昆明小鼠，7-9周龄，雌雄各半，体重15-24g，购自河北医科大学实验动物中心（合格证号：1003008）。动物在实验前适应性驯养1周。
1.2 瘤株
小鼠S180腹水株由河北大学药学院传代保存。
1.3 黄精水提物的制备
称取黄精（由河北大学附属医院中药房提供，所有药品均经中药专家鉴定）40 g，蒸馏水浸泡2 h后，分別加8倍量、6倍量、4倍量的水煎煮3次，时间分别为药液熬开后60 min、40 min、30 min，将三次煎煮的药液混合，离心，取上清，用旋转蒸发仪低温浓缩至每毫升相当于原生药材1 g的浓度，即得黄精水提取物，即为高剂量的中药（1 g/mL），中剂量的中药加蒸馏水稀释一倍即可。水提物置4℃低温保存备用。
1.4 注射用环磷酰胺腹腔注射液的配制
购自河北大学附属医院，由山西普德药业有限公司生产（批号：20090903），0.2 g/支，临用前以生理盐水倍比稀释至2 mg/mL，放置4℃冰箱避光保存。
1.5 仪器
超级恒温水浴（山东鄄城华鲁仪器有限公司，型号：HH-601）
电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司，型号：AE240）
超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司， 型号：SW-CJ-2FD）
可见分光光度计（精华科技仪器有限公司 ，型号：722）
倒置显微镜（南京江南永新光学有限公司）
台式低速离心机（北京京立离心机有限公司，型号：LD4-1.8）
1.6 S180瘤源小鼠的复制
将冻存的S180细胞取出，置37℃水浴锅中使融化，以生理盐水洗涤一次，然后低速离心，弃上清液，再用生理盐水稀释后，取0.5 mL注入小鼠腹腔内。
1.7 肿瘤接种造模
S180细胞培养7天后，选择精神状态好，腹水饱满的小鼠断颈处死，于无菌条件下消毒鼠腹，抽取癌性腹水，按1：3比例用生理盐水稀释，吹吸均匀，再以3000转离心5 min，弃上清液，再加入生理盐水调配成浓度为1.75×107个瘤细胞/mL的细胞悬液。每鼠接种0.2 mL（约含3.5×106个瘤细胞）于右腋窝下。
1.8 实验动物分组
小鼠接种瘤细胞24 h后，称重、编号，按巡回顺序法随机分4组，每组10只，各组小鼠用3%苦味酸标记，自由摄取饲料，量不限，自由饮用蒸馏水。
1.9 实验动物的给药方法
① 荷瘤组：生理盐水0.4 mL灌胃，同时约5小时后腹腔注射生理盐水0.2 mL ，1天1次，共11天；② CTX组：生理盐水0.4 mL灌胃，同时5小时后腹腔注射CTX 0.1 mL/10g（20 mg/kg）， l天1次，共11天；③ 黄精中剂量组：中剂量（10 g/kg） 黄精0.2 mL/10 g灌胃，同时约5小时后腹腔注射CTX0.1 mL/10 g（20 mg/kg）， l天1次，共11天；④ 黄精高剂量组：高剂量（20 g/kg）黄精0.2 mL/10 g灌胃，同时约5小时后腹腔注射CTX0.1 mL/10 g（20 mg/kg），l天1次，共11天。
1.10 检测指标及其方法
1.10.1 瘤重和抑瘤率
在第12天，将小鼠眼球摘除取血后断颈处死，依次用碘酊酒精消毒操作部位皮肤，于超净工作台上，以无菌操作从腋部皮下完整剥取肿瘤组织，剥离干净后于电子天平称瘤体质量并计算抑瘤率。
肿瘤抑制率（%）=（荷瘤组平均瘤重-各给药组平均瘤重）/荷瘤组平均瘤重
1.10.2 肝、肾、脾、胸腺指数的测定
剥离其肝 、肾 、脾 、胸腺，用电子分析天平称重，按公式计算各脏器指数。 脏器指数=脏器重（mg）/鼠重（g）
1.11 统计方法
各组数据以均数±标准差（ ）表示，采用SPSS统计软件进行分析，多组间比较用One-Way ANOVA方差分析。
2 实验结果
2.1 黄精对化疗小鼠肿瘤生长的影响
如表1所示：与荷瘤组相比，各给药组的瘤重均显著下降，具有统计学意义 （P<0.01），与CTX组相比，黄精高、中剂量组抑瘤率均大于CTX组，且黄精高剂量组的瘤重差异具有显著性（P<0.05）。
表1 各组荷瘤小鼠瘤重与抑瘤率的比较（ ）
注：与荷瘤组相比，** P<0.01；与CTX组相比，#P<0.05。
2.2 黄精对化疗小鼠免疫器官的影响
由表2可见：与荷瘤组相比，单用CTX组和联合用黄精高中剂量组的胸腺指数和脾脏指数均有统计学差异（P <0.05，P <0.01），与CTX组相比，黄精高、中剂量组胸腺指数和脾脏指数均显著升高，差异有显著性（P<0.01，P<0.05）。
表2 黄精对化疗小鼠免疫器官重量的影响（ ）
注：与荷瘤组相比，** P<0.01，* P<0.05；与CTX组相比，# P<0.05，## P<0.01。
4 讨论
肿瘤能抑制机体的免疫功能，而化疗药物可加重机体的免疫抑制[8-9]。目前临床常用的化疗药物多数可损伤机体的免疫系统，胸腺、脾脏指数从免疫器官发育的角度反映了机体的免疫能力，可作为评价药物对机体免疫功能影响的指标。本实验结果显示，与荷瘤组相比，CTX组小鼠的胸腺指数和脾脏指数均显著降低，表明CTX可致免疫器官萎缩，对小鼠的免疫功能具有抑制作用。与CTX组相比，黄精高、中剂量组胸腺指数和脾脏指数均显著升高，表明黄精对CTX所致的免疫器官的萎缩具有一定的保护作用。
5 结论
综上所述，黄精与环磷酰胺合用对治疗肿瘤具有协同抑制作用，黄精可抑制荷瘤小鼠的移植性肿瘤的生长，与化疗药物环磷酰胺联合抗肿瘤具有增效作用，可减轻CTX对化疗小鼠免疫器官的毒性作用，保护荷瘤小鼠的脾脏和胸腺并促进其生长，这为黄精应用于临床或作为化疗后辅助用药提供了一定实验依据。
参考文献
[1]国家药典委员会. 中华人民共和国药典2010年版（一部）. 北京： 中国医药科技出版社， 2010： 288.
[2]江华. 黄精多糖的抗肿瘤活性研究[J]. 南京中医药大学学报， 2010， 26（6）：479～480.
[3]叶红翠， 张小平， 余红， 等. 多花黄精粗多糖抗肿瘤活性研究[J].中国实验方剂学杂志， 2008， 14（6）：34～36.
[4]张峰，高群，孔令雷，等. 黄精多糖抗肿瘤作用的实验研究[J]. 中国实用医药杂志，2007，2（21）：95～96.
[5]陸建平， 张静， 张艳贞. 黄精多糖的功能活性及应用前景[J]. 食品安全质量检测学报， 2013， 4（1）： 273～278.