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摘要：
以25个山东省小麦主推品种为试材，分别采用PAGE和SDS-PAGE技术对小麦醇溶蛋白及麦谷蛋白进行分离，用以鉴定小麦品种。结果表明，醇溶蛋白PAGE技术对蛋白质组分的分离具有良好的多态性和特异性，该方法操作简便、重复性好、成本低，是目前小麦品种鉴定的主要方法。麦谷蛋白SDS-PAGE技术具有谱带清晰、分辨力较高等特点，但操作繁琐，分离时间长。对于醇溶蛋白难以区分的品种，麦谷蛋白可作为品种鉴定的有效补充。
关键词：醇溶蛋白；麦谷蛋白；PAGE；SDS-PAGE；品种鉴定
中图分类号：S512.103.7文献标识号：A文章编号：1001-4942（2015）03-0105-04
Application Research of Gliadin and Glutenin
in Wheat Variety Identification
Yan Tingjin，Li Qun*，Dai Shuang，Tian Qian
（Shandong Center of Crop Germplasm Resources， Jinan 250100， China）
Abstract In order to determine the varieties of wheat， the gliadin and glutenin extracted from 25 wheat varieties were analyzed using polyacrylamide gel electrophoresis（PAGE）and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis（SDS-PAGE）. The results showed that the gliadin PAGE technique， as the main method of wheat variety identification at present， had good polymorphism and specificity on separation of protein components with the advantages of simple operation， good repeatability and low cost. Glutenin SDS-PAGE technique showed clear hands and high resolution but time-consuming in operation. Glutenin could be an effective complement to varieties which was difficult to distinguish through gliadin.
Key wordsGliadin；Glutenin； PAGE；SDS-PAGE；Variety identification
随着先进分离技术的出现，近几年小麦种子贮藏蛋白在分子水平上的研究得到较快发展。小麦籽粒蛋白按其溶解性可分为溶于水的白蛋白、溶于盐的球蛋白、溶于酸或碱的谷蛋白和溶于醇的醇溶蛋白。白蛋白和球蛋白合称为代谢蛋白，约占籽粒蛋白总量的15%左右。醇溶蛋白和谷蛋白合称为贮藏蛋白，约占籽粒蛋白总量的85%左右。小麦醇溶蛋白是一种小分子单体蛋白；而麦谷蛋白是一种非均质的大分子聚合体，靠分子内和分子间的二硫键连结，呈纤维状，容易发生聚集作用，根据其分子量的大小又分为高分子量谷蛋白（HMW）和低分子量谷蛋白（LMW）。
小麦贮藏蛋白组成成分仅由遗传因素决定，不受发育时期的生理条件及外界环境因素的影响，因此能真实地反映出小麦品种之间基因表达上的差异。小麦醇溶蛋白在其组成上具有高度特异性和多态性，是区分小麦品种差别的重要蛋白质成分之一，目前已广泛应用于种子纯度鉴定、品种分类、品质改良以及预测杂种优势等科研和生产中[1，2，4～10，13～16]；麦谷蛋白在品种间的变异广泛，因此也可根据其组成上的差异对不同的基因型进行准确鉴定[3，7，11～13，17]。
目前小麦品种真实性和纯度鉴定以醇溶蛋白PAGE电泳技术为主，但该技术对于有些品种特别是亲缘关系比较近的品种难以区分，而关于小麦高分子量谷蛋白多用于其亚基的组成与小麦烘烤品质关系和以及其遗传变异小麦遗传演化与群体分化的研究[2～11]。本研究试图通过SDS-PAGE电泳技术对麦谷蛋白组分进行分析，作为醇溶蛋白电泳技术的补充，以便更好地区分小麦品种之间的差异。
1材料与方法
1.1试验材料
选用25个山东省小麦主推品种，由山东省农业科学院作物研究所小麦研究室提供，见表1。
1.2试验方法
1.2.1小麦醇溶蛋白PAGE技术采用《农作物种子检验规程》（GB/T3543.5-1995附录A）聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）。
取单粒种子用粉碎器磨碎，置于离心管中，加样品提取液200 μL，静置2 h。提取液含0.05%甲基绿、25%α-氯乙醇。
取上清液12 μL进行电泳。凝胶液（改进后）含15%丙稀酰胺、0.5%N，N-亚甲基双丙稀酰胺、6%尿素、0.005%硫酸亚铁、0.1%抗坏血酸、0.1%甘氨酸、2%醋酸。电极缓冲液含0.04%甘氨酸、0.4%醋酸。
采用垂直板夹芯电泳槽，恒压350 V，电泳1 h关机。0.5%考马斯亮蓝和10%三氯乙酸以1∶20比例混合，将凝胶片放入，染色1 h即可观察图谱。
1.2.2麦谷蛋白SDS-PAGE技术参照《小麦植物新品种测试指南》中规定的SDS-PAGE测定高分子量麦谷蛋白方法。 每品种取10粒种子，单粒粉碎放入2 mL离心管中，加入500 μL提取液[含0.09 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）、0.03% SDS、0.015%溴酚蓝、15%甘油、7.5%巯基乙醇]，振荡混匀，室温下提取2 h，沸水浴10 min，离心5 min，取上清液。
SDS-PAGE凝胶电泳采用不连续分离系统。分离胶含10% Acry、0.13% Bis、0.38 mol/L Tris-HCl （pH 8.8），0.1% SDS；浓缩胶含4% Acry、0.06% Bis、0.17 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）、0.1% SDS；电极缓冲液（pH 8.8）含1.4% Gly、0.3% Tris、0.1% SDS。
采用垂直板夹芯电泳槽，恒压100 V，电泳12 h。染色液含10%三氯乙酸、0.025%考马斯亮蓝R-250，染色4 h。用蒸馏水浸泡8 h，直至胶片背景变浅或无色。
2结果与分析
2.1醇溶蛋白PAGE分离结果
在聚丙烯酰胺（PAGE）电泳条件下，小麦醇溶蛋白能分成15～30个组分，按其分子量大小分为α、β、γ、ω 4种蛋白，品种区分主要以α蛋白为主。结果显示，该技术对于醇溶蛋白的分离表现出良好的多态性（图1），25个小麦品种中有17个品种有明显的特征带，具有很好的特异性。但仍有4组品种电泳图谱相似，具体表现为第4号带（烟农2415）和第5号带（烟农5158）相似、第12号带（良星66）和第13号带（良星99）相似、第21条带（潍麦8号）和第23条带（莱州137）相似、第1号带（汶农14）和第25号带（良星619）相似。究其原因，烟农2415和烟农5158、良星66和良星99分别为同一育种单位选育出来的品种，亲缘关系比较近，遗传背景狭窄；潍麦8号和莱州137、汶农14和良星619两组品种可能具有共同的亲本或相近的亲缘关系，因此利用该技术无法区分其品种间的差异。
2.2麦谷蛋白SDS-PAGE分离结果
利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）技术可将麦谷蛋白分为高分子谷蛋白和低分子谷蛋白，从电泳图谱可以看出（图2），该项技术也具有很好的多态性，其中高分子量谷蛋白具有较好的特异性，25个小麦品种中的19个都具有明显的特征带，很容易和其他品种区分开来。但也有3组品种电泳图谱相似，其中12和13号谱带（良星66和良星99）、1和25号谱带（汶农14和良星619）完全相似；17和18号谱带（青麦6号和济宁16）在高分子蛋白区相似，但在低分子蛋白区有差异；在醇溶蛋白电泳图谱中表现相似的4号带和5号带（烟农2415和烟农5158）、21号带和23号带（潍麦8号和莱州137）在麦谷蛋白电泳图谱中却具有特异性，二者很容易区分。
蛋白质作为基因表达的产物，其图谱的差异反映基因的差异。就整个电泳图谱来看，高分子量亚基相同的品种，低分子量亚基也可能存在差异，因此品种的鉴别除从麦谷蛋白高分子量亚基来判断性状差异外，还可以考虑低分子量亚基。
3讨论与结论
3.1醇溶蛋白电泳方法具有简单快速、重复性好、准确可靠、低成本等特点，目前已广泛应用于小麦品种鉴定，同时也被《农作物种子检验规程》采用，可作为检验方法的首选，满足种子检验数量大、品种多的需求。麦谷蛋白SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱清晰，分辨率较高，但分离时间长，操作繁琐，可作为补充。对于少数因遗传基础相近，在田间农艺性状表现有差异，而在蛋白质水平无法鉴定的品种，则可采用DNA分子标记技术。
3.2种子贮藏蛋白的组成由遗传物质决定，不受环境影响，其组成的差异可以反映基因型的不同。小麦是自花授粉作物，品种的基因型为纯合型，一个品种通常只有一种蛋白质的电泳图谱[18]。醇溶蛋白和麦谷蛋白作为品种鉴定的生化指标，只要测试品种与标准品种电泳图谱不同，就可以作为有差异的性状。
在小麦品种纯度和真实性鉴定实际应用中，应以醇溶蛋白电泳技术为主要的检测体系，辅以麦谷蛋白电泳技术，二者相互补充，对于农作物品种鉴定、遗传分类、品质分析都具有重要意义。
参考文献：
[1]
颜启传，黄亚军，徐媛.我国适用的小麦和大麦种子醇溶蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定品种的标准程序[J].种子，1989（6）：55-57.
[2]阎旭东，卢少源，李宗智.适用于我国小麦醇溶蛋白分析的APAGE方法[J].河北农业大学学报，1994，17（1）：7-10.
[3]晏月明，刘广田，Prodanovic S.小麦谷蛋白亚基的凝胶电泳分离及其品种鉴定[J].中国粮油学报，1998，13（6）：1-5.
[4]邵锦，丁毅.麦醇溶蛋白A-PAGE方法的优化和改进[J].武汉大学学报：自然科学版，2000，46（6）：733-738.
[5]高居荣，王洪刚，刘树兵，等.小麦种子醇溶蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的简化研究 [J].华北农学报，2003，18（2）：43-46.
[6]董洪平.小麦醇溶蛋白电泳分析及其在品种分类上的应用[J].河北农业技术师范学院学报， 1999，13（2）：1-4.
[7]董超华，徐如洪，张庆勤.小麦醇溶蛋白和谷蛋白研究进展[J].山地农业生物学报，2003，22（2）：164-168.
[8]张茶，梁虹，王睿辉，等.河北省主栽小麦品种醇溶蛋白遗传多样性分析[J].中国农学通报，2008，24（1）：191-193.
[9]张学勇，杨欣明，马守才，等.醇溶蛋白电泳在小麦种质资源遗传分析中的应用[J].中国农业科学，1995，28（4）：25-32.
[10]马守才，张改生，刘宏伟，等.多种小麦蛋白质酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法研究[J].麦类作物学报，2000，20（4）：55-58. [11]司学芝，李建伟 王金水，等.麦醇溶蛋白和麦谷蛋白提取条件的研究[J].郑州工程学院学报，2004，25（3）：33-39.
[12]虎梦霞.小麦低分子量麦谷蛋白亚基（LMW-GS）研究进展[J].甘肃农业科技，2014（1）：43-46.
[13]牛瑜琦，刘少翔，闫贵云，等.小麦高分子量谷蛋白亚基研究进展[J].现代农业科技，2011（3）：11-15.
[14]Dachkevitch T，Redaelli R，Biancardi A M，et al.Genetics of gliadins coded by the group 1 chromosomes in the high-quality bread wheat cultivar Neepawa[J].Theor.Appl.Genet.，1993，86（3）：389-399.
[15]Cox T S，Lookhart G L，Walker D E，et al.Genetic relationships among hardred winter wheat cultivars as evaluated by pedigree analysis and gliadin polyacrylamide gel electrophoretic patterns[J].Crop Sci.，1985，25：1058-1063.
[16]Payne P I.Genetics of wheat storage proteins and the effect of allelic variation in bread-making quality[J].Annual Review of Plant Biology，2003，38：141-153.
[17]Jackson E A，Holt L M，Payne P I.Characterizations of high molecular weight gliadin and low molecular weight glutenin subunits of wheat endosperm by two-dimension electrophoresis and the chromosomal localization of their controlling genes[J].Thero.Appl.Genet.，1983，66（1）：29-37.
[18]兰海燕，李立会.蛋白质凝胶电泳技术在作物品种鉴定中的应用[J].中国农业科学，2002，35（8）：916-920.
以25个山东省小麦主推品种为试材，分别采用PAGE和SDS-PAGE技术对小麦醇溶蛋白及麦谷蛋白进行分离，用以鉴定小麦品种。结果表明，醇溶蛋白PAGE技术对蛋白质组分的分离具有良好的多态性和特异性，该方法操作简便、重复性好、成本低，是目前小麦品种鉴定的主要方法。麦谷蛋白SDS-PAGE技术具有谱带清晰、分辨力较高等特点，但操作繁琐，分离时间长。对于醇溶蛋白难以区分的品种，麦谷蛋白可作为品种鉴定的有效补充。
关键词：醇溶蛋白；麦谷蛋白；PAGE；SDS-PAGE；品种鉴定
中图分类号：S512.103.7文献标识号：A文章编号：1001-4942（2015）03-0105-04
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Abstract In order to determine the varieties of wheat， the gliadin and glutenin extracted from 25 wheat varieties were analyzed using polyacrylamide gel electrophoresis（PAGE）and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis（SDS-PAGE）. The results showed that the gliadin PAGE technique， as the main method of wheat variety identification at present， had good polymorphism and specificity on separation of protein components with the advantages of simple operation， good repeatability and low cost. Glutenin SDS-PAGE technique showed clear hands and high resolution but time-consuming in operation. Glutenin could be an effective complement to varieties which was difficult to distinguish through gliadin.
Key wordsGliadin；Glutenin； PAGE；SDS-PAGE；Variety identification
随着先进分离技术的出现，近几年小麦种子贮藏蛋白在分子水平上的研究得到较快发展。小麦籽粒蛋白按其溶解性可分为溶于水的白蛋白、溶于盐的球蛋白、溶于酸或碱的谷蛋白和溶于醇的醇溶蛋白。白蛋白和球蛋白合称为代谢蛋白，约占籽粒蛋白总量的15%左右。醇溶蛋白和谷蛋白合称为贮藏蛋白，约占籽粒蛋白总量的85%左右。小麦醇溶蛋白是一种小分子单体蛋白；而麦谷蛋白是一种非均质的大分子聚合体，靠分子内和分子间的二硫键连结，呈纤维状，容易发生聚集作用，根据其分子量的大小又分为高分子量谷蛋白（HMW）和低分子量谷蛋白（LMW）。
小麦贮藏蛋白组成成分仅由遗传因素决定，不受发育时期的生理条件及外界环境因素的影响，因此能真实地反映出小麦品种之间基因表达上的差异。小麦醇溶蛋白在其组成上具有高度特异性和多态性，是区分小麦品种差别的重要蛋白质成分之一，目前已广泛应用于种子纯度鉴定、品种分类、品质改良以及预测杂种优势等科研和生产中[1，2，4～10，13～16]；麦谷蛋白在品种间的变异广泛，因此也可根据其组成上的差异对不同的基因型进行准确鉴定[3，7，11～13，17]。
目前小麦品种真实性和纯度鉴定以醇溶蛋白PAGE电泳技术为主，但该技术对于有些品种特别是亲缘关系比较近的品种难以区分，而关于小麦高分子量谷蛋白多用于其亚基的组成与小麦烘烤品质关系和以及其遗传变异小麦遗传演化与群体分化的研究[2～11]。本研究试图通过SDS-PAGE电泳技术对麦谷蛋白组分进行分析，作为醇溶蛋白电泳技术的补充，以便更好地区分小麦品种之间的差异。
1材料与方法
1.1试验材料
选用25个山东省小麦主推品种，由山东省农业科学院作物研究所小麦研究室提供，见表1。
1.2试验方法
1.2.1小麦醇溶蛋白PAGE技术采用《农作物种子检验规程》（GB/T3543.5-1995附录A）聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）。
取单粒种子用粉碎器磨碎，置于离心管中，加样品提取液200 μL，静置2 h。提取液含0.05%甲基绿、25%α-氯乙醇。
取上清液12 μL进行电泳。凝胶液（改进后）含15%丙稀酰胺、0.5%N，N-亚甲基双丙稀酰胺、6%尿素、0.005%硫酸亚铁、0.1%抗坏血酸、0.1%甘氨酸、2%醋酸。电极缓冲液含0.04%甘氨酸、0.4%醋酸。
采用垂直板夹芯电泳槽，恒压350 V，电泳1 h关机。0.5%考马斯亮蓝和10%三氯乙酸以1∶20比例混合，将凝胶片放入，染色1 h即可观察图谱。
1.2.2麦谷蛋白SDS-PAGE技术参照《小麦植物新品种测试指南》中规定的SDS-PAGE测定高分子量麦谷蛋白方法。 每品种取10粒种子，单粒粉碎放入2 mL离心管中，加入500 μL提取液[含0.09 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）、0.03% SDS、0.015%溴酚蓝、15%甘油、7.5%巯基乙醇]，振荡混匀，室温下提取2 h，沸水浴10 min，离心5 min，取上清液。
SDS-PAGE凝胶电泳采用不连续分离系统。分离胶含10% Acry、0.13% Bis、0.38 mol/L Tris-HCl （pH 8.8），0.1% SDS；浓缩胶含4% Acry、0.06% Bis、0.17 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）、0.1% SDS；电极缓冲液（pH 8.8）含1.4% Gly、0.3% Tris、0.1% SDS。
采用垂直板夹芯电泳槽，恒压100 V，电泳12 h。染色液含10%三氯乙酸、0.025%考马斯亮蓝R-250，染色4 h。用蒸馏水浸泡8 h，直至胶片背景变浅或无色。
2结果与分析
2.1醇溶蛋白PAGE分离结果
在聚丙烯酰胺（PAGE）电泳条件下，小麦醇溶蛋白能分成15～30个组分，按其分子量大小分为α、β、γ、ω 4种蛋白，品种区分主要以α蛋白为主。结果显示，该技术对于醇溶蛋白的分离表现出良好的多态性（图1），25个小麦品种中有17个品种有明显的特征带，具有很好的特异性。但仍有4组品种电泳图谱相似，具体表现为第4号带（烟农2415）和第5号带（烟农5158）相似、第12号带（良星66）和第13号带（良星99）相似、第21条带（潍麦8号）和第23条带（莱州137）相似、第1号带（汶农14）和第25号带（良星619）相似。究其原因，烟农2415和烟农5158、良星66和良星99分别为同一育种单位选育出来的品种，亲缘关系比较近，遗传背景狭窄；潍麦8号和莱州137、汶农14和良星619两组品种可能具有共同的亲本或相近的亲缘关系，因此利用该技术无法区分其品种间的差异。
2.2麦谷蛋白SDS-PAGE分离结果
利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）技术可将麦谷蛋白分为高分子谷蛋白和低分子谷蛋白，从电泳图谱可以看出（图2），该项技术也具有很好的多态性，其中高分子量谷蛋白具有较好的特异性，25个小麦品种中的19个都具有明显的特征带，很容易和其他品种区分开来。但也有3组品种电泳图谱相似，其中12和13号谱带（良星66和良星99）、1和25号谱带（汶农14和良星619）完全相似；17和18号谱带（青麦6号和济宁16）在高分子蛋白区相似，但在低分子蛋白区有差异；在醇溶蛋白电泳图谱中表现相似的4号带和5号带（烟农2415和烟农5158）、21号带和23号带（潍麦8号和莱州137）在麦谷蛋白电泳图谱中却具有特异性，二者很容易区分。
蛋白质作为基因表达的产物，其图谱的差异反映基因的差异。就整个电泳图谱来看，高分子量亚基相同的品种，低分子量亚基也可能存在差异，因此品种的鉴别除从麦谷蛋白高分子量亚基来判断性状差异外，还可以考虑低分子量亚基。
3讨论与结论
3.1醇溶蛋白电泳方法具有简单快速、重复性好、准确可靠、低成本等特点，目前已广泛应用于小麦品种鉴定，同时也被《农作物种子检验规程》采用，可作为检验方法的首选，满足种子检验数量大、品种多的需求。麦谷蛋白SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱清晰，分辨率较高，但分离时间长，操作繁琐，可作为补充。对于少数因遗传基础相近，在田间农艺性状表现有差异，而在蛋白质水平无法鉴定的品种，则可采用DNA分子标记技术。
3.2种子贮藏蛋白的组成由遗传物质决定，不受环境影响，其组成的差异可以反映基因型的不同。小麦是自花授粉作物，品种的基因型为纯合型，一个品种通常只有一种蛋白质的电泳图谱[18]。醇溶蛋白和麦谷蛋白作为品种鉴定的生化指标，只要测试品种与标准品种电泳图谱不同，就可以作为有差异的性状。
在小麦品种纯度和真实性鉴定实际应用中，应以醇溶蛋白电泳技术为主要的检测体系，辅以麦谷蛋白电泳技术，二者相互补充，对于农作物品种鉴定、遗传分类、品质分析都具有重要意义。
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