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摘要：目的 观察补肾健脾方对人结肠癌移植瘤生长及血清血管内皮生长因子（VEGF）和基质金属蛋白酶7（MMP-7）表达的影响，探讨其抗结肠癌的部分作用机制。方法 裸鼠腋下接种人结肠癌细胞，建立人结肠癌裸鼠皮下移植瘤模型。随机分为模型组、5-氟尿嘧啶组和补肾健脾方低、中、高剂量组，各给药组给予相应药物，连续3周。各组处死6只荷瘤鼠，测量瘤体质量，计算相对抑瘤率；ELISA测定血清VEGF及MMP-7表达；剩余荷瘤鼠用于观察生存时间。结果 补肾健脾方各剂量组瘤体质量较模型组均明显降低，荷瘤鼠生存时间较模型组明显延长；与模型组比较，补肾健脾方各剂量组VEGF、MMP-7表达均明显下降。结论 补肾健脾方可抑制人结肠癌裸鼠皮下移植瘤生长、延长荷瘤鼠生存时间，其机制可能与下调 VEGF、MMP-7表达有关。
关键词：补肾健脾方；结肠癌；血管内皮生长因子；基质金属蛋白酶7；BALB/c 裸鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.06.013
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）06-0053-03
Effects of Bushen Jianpi Prescription on Tumor Growth in Subcutaneous Colorectal Cancer Xenografts in Mice and Expressions of VEGF and MMP-7
WANG Yuan-hui1，2， FENG Yuan-yuan2， HAN Zhi-fen2， SUN Xiao-ting2， LIU Xuan2， DENG Wan-li2， LI Qi2
1. Jiangwan Hospital， Hongkou District， Shanghai 200434， China；
2. Shuguang Hospital， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China
Abstract： Objective To investigate the effects of Bushen Jianpi Prescription on tumor growth in subcutaneous colorectal cancer xenografts in mice and expressions of VEGF and MMP-7； To discuss its mechanism of anti-colon cancer. Methods Nude mice were inoculated subcutaneously into human colon cancer cells to establish human colon cancer xenograft models. Nude mouse models of subcutaneous colorectal cancer xenografts were randomly divided into model group， 5-FU group， Bushen Jianpi low-， medium-， and high-dose groups. Each medication group was given relevant medicine for three weeks. Six tumor-bearing mice in each group were sacrificed. Tumor mass was measured， and the relative inhibition rate was calculated. The serum levels of VEGF and MMP-7 were measured by ELISA. The remaining tumor-bearing mice were used to observe the survival time. Results Compared with model group， the weight of tumor were reduced and the median survival time of mice were prolonged in Bushen Jianpi groups， as well as the expression levels of VEGF and MMP-7 significantly decreased Bushen Jianpi groups. Conclusion Bushen Jianpi Prescription can inhibit the growth of human colon cancer xenografts in nude mice and prolong the survival time of tumor-bearing mice， which may be related to the down-regulation of the expressions of VEGF and MMP-7.
Keywords： Bushen Jianpi Prescription； colorectal cancer； VEGF； MMP-7； BALB/c nude mice
大腸癌目前治疗方法以手术切除、放化疗为主，但仍有高复发率、高转移率及高病死率的特点。中医药在防治肿瘤复发和转移有一定的疗效[1-2]。复方补肾健脾方是上海中医药大学附属曙光医院肿瘤科临床经验方，有益气补肾健脾、解毒消肿散结之功效，临床疗效较好[3]，但其机制尚不明确。本实验建立人结肠癌裸鼠皮下移植瘤模型，采用补肾健脾方进行干预，观察其对人结肠癌裸鼠移植瘤的作用，探讨其抗结肠癌的部分机制，为其临床应用提供依据。 1 实验材料
1.1 细胞株与动物
人结肠癌细胞株LoVo，上海博谷生物有限公司。雄性BALB/c裸鼠80只，SPF级，4～6周龄，体质量18～20 g，上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物许可证号SCXK（沪）2016-0019。饲养于上海中医药大学SPF级实验动物中心。
1.2 药物
补肾健脾方由黄芪、白术、女贞子、肉苁蓉、野葡萄藤、石见穿、八月札组成，其提取物由上海医药工业研究院制备及质量控制。
1.3 主要试剂与仪器
F12K培养基及胎牛血清，美国Gibco公司；5-氟尿嘧啶（5-FU），上海旭东海普药业有限公司；人血管内皮生长因子（VEGF）、人基质金属蛋白酶7（MMP-7）ELISA试剂盒，上海博谷生物科技有限公司。双人垂直流超净工作台（新加坡ESCO），台式低速离心机（德国Eppendorf），荧光倒置显微镜（日本OLMYPUS），CO2培养箱（英国RSBiotech）。
2 实验方法
2.1 细胞培养
F12K培养基（10%胎牛血清、1.5 g/L碳酸氢钠、1.5 mmol/L L-谷氨酰胺）培养人结肠癌LoVo细胞，置于37 ℃、饱和湿度、5%CO2孵箱。
2.2 人结肠癌裸鼠移植瘤模型建立
将人结肠癌LoVo细胞制成浓度为1×107/mL悬液。取3只BALB/c裸鼠，将细胞悬液接种于裸鼠背部近右上肢皮肤（其中一只双侧上肢皮肤），接种量0.2 mL/只。待瘤体生长直径达1～1.2 cm，选择肿瘤瘤体生长相对比较旺盛且无溃破荷瘤鼠作为供瘤鼠，剥取瘤体，去除坏死组织及纤维组织，选择肿瘤边缘相对比较新鲜的肿瘤组织，将其剪成约1 mm3，无菌环境将其接种到裸鼠右侧腋窝的皮下。按上述方法予以传代2代后，将肿瘤组织大量接种于裸鼠腋窝皮下，构建人结肠癌裸鼠皮下移植瘤模型。待肿瘤生长到体积约100～300 mm3，进行后续实验。
2.3 分组及给药
将动物随机分为模型组、5-FU组和补肾健脾方低剂量（BSJP-L）、中剂量（BSJP-M）、高剂量（BSJP-H）组，每组12只。BSJP-L组、BSJP-M组、BSJP-H组予补肾健脾方提取物250、500、1000 mg/（kg·d）灌胃，5-FU组每2 d腹腔注射5-FU 50 mg/kg，模型组予等体积生理盐水灌胃。给药体积均为5 mL/kg，连续3周。
2.4 检测指标
实验期间每隔1 d测量肿瘤直径并称定裸鼠体质量。给药3周后将每组6只裸鼠处死后摘除眼球并取血，收集血清，取出移植瘤瘤体，测量瘤体长、短径及质量，瘤体用福尔马林固定，石蜡包埋。计算肿瘤体积（TV=ab2/2，a、b分别表示肿瘤长、短径）和抑瘤率[（l-实验组平均瘤质量÷对照组平均瘤质量）×100%]。每组剩余6只裸鼠用于观察生存时间，计算生存延长率[（治疗组平均生存天数-对照组平均生存天数）÷对照组平均生存天数×100%]。
ELISA检测血清VEGF和MMP-7表达，严格按试剂盒说明书进行操作。
3 统计学方法
采用SPSS18.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，采用方差分析，组间比较用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 补肾健脾方对人结肠癌裸鼠移植瘤抑瘤率的影响
随给药时间延长，各组瘤体体积大小逐渐出现差距，各给药组瘤体质量小于模型组（P<0.05，P<0.01）；各给药组抑瘤率比较差异明显（P<0.01）。结果见表1。
4.2 补肾健脾方对荷瘤鼠生存时间的影响
各给药组荷瘤鼠中位生存时间较模型组明显延长（P<0.05，P<0.01），各给药组生存延长率比较差异有统计学意义（P<0.01）。结果见表2。
4.3 补肾健脾方对荷瘤鼠血清血管内皮生长因子和基质金属蛋白酶7表达的影响
各给药组VEGF、MMP-7表達较模型组明显下降（P<0.05，P<0.01），各给药组VEGF、MMP-7表达比较差异有统计学意义（P<0.01）。结果见表3。
5 讨论
大肠癌属中医学“肠溜”“肠澼”“积聚”等范畴。中医学认为，本虚标实是大肠癌的病机特点，本虚为脾肾亏虚，标实为湿热毒邪积聚。本课题组前期研究发现，大肠癌在脾虚湿热证的基础上，转移患者多伴有肾虚或者潜在肾虚的特征。因此，治法当以益气补肾健脾为主，兼顾解毒消肿散结。补肾健脾方中黄芪补气健脾，肉苁蓉、女贞子益肾，三者合用为君，以实补肾健脾之能；白术功主健脾益气，是以为臣；石见穿、野葡萄藤二者合用以主清热解毒、软坚散结之功，八月札功主理气，共行佐使之责。诸药集补脾、益肾、消结、化瘤之功效为一体。综观全方，药虽简，然力专甚，扶正不助邪，驱邪不伤正。本实验通过建立人结肠癌裸鼠皮下移植瘤模型，采用补肾健脾方进行干预，发现补肾健脾方可明显抑制人结肠癌裸鼠肿瘤的生长。进一步观察荷瘤鼠生存期，发现补肾健脾方可明显延长荷瘤鼠的生存时间。
肿瘤血管新生或血管生成是实体瘤生长非常关键的因素。恶性肿瘤的生长、浸润和转移有赖于肿瘤血管的生成，如无血管生成，原发肿瘤生长不会超过1～2 mm3，其继续生长必须依赖新血管的形成，以提供足够的营养和氧，带走代谢产物。同时新生血管管壁不完整，呈高通透状态，利于肿瘤细胞的转移。肿瘤血管生成受血管生成因子和血管生成抑制因子两者的有机调控：一旦血管生成因子上调或血管生成抑制因子功能障碍，二者平衡被打破即发生肿瘤血管新生[4-6]。VEGF是刺激肿瘤血管生成的最强的、特异性最高的促血管生长因子之一。当VEGF呈现高表达时，能明显刺激血管内皮细胞，使其快速增殖，进而介导大量血管的新生，从而为肿瘤组织的生长提供所必需的大量营养及能量，促进肿瘤细胞的侵袭和转移[7]。MMP-7在MMPs家族中与肿瘤的关系最为密切，是唯一在肿瘤细胞而非肿瘤间质表达的MMPs。当MMP-7被激活后，它不仅能通过促进血管内皮细胞的增殖来介导肿瘤新生血管的生成，还能通过抑制肿瘤细胞的凋亡来促进肿瘤细胞的生长。本实验采用ELISA检测补肾健脾方对裸鼠血清VEGF和MMP-7表达，结果显示，与模型组比较，补肾健脾方低、中、高剂量组VEGF、MMP-7表达明显下降。 综上，补肾健脾方能抑制裸鼠皮下移植瘤的生长，延长荷瘤鼠的生存时间，其机制可能与下调VEGF和MMP-7表达有关。
参考文献：
[1] TAN K Y， LIU C B， CHEN A H， et al. The role of traditional Chinese medicine in colorectal cancer treatment[J]. Tech Coloproctol， 2008，12（1）：1-6.
[2] CHANG K H， BRODIE R， CHOONG M A， et al. Complementary and alternative medicine use in oncology：a questionnaire survey of patients and health care professionals[J]. BMC Cancer，2011，11：196.
[3] 张彦博，刘宣，季青，等.健脾解毒方联合化疗治疗转移性结直肠癌临床研究[J].中华中医药杂志，2015，30（6）：2090-2093.
[4] FOLKMAN J. Clinical applications of research on angiogenesis：seminars in medicine of the Beth Israel Hospital[J]. N Engl J Med，1995，333（26）：1757.
[5] THOMPSON W D，LIW W，MARAGOUDAKIS M. The clinical manipulation of angiogenesis：pathology， side-effects， surprises， and opportunities with novel human therapies[J]. J Pathol，2000， 190（3）：330.
[6] KAWASAKI T， NOSHO K， OHNISHI M， et al. Correlation of beta- catenin localization with cyclooxygenase-2 expression and CpG island methylator phenotype （CIMP） in colorectal cancer[J]. Neoplasia，2007，9（7）：569.
[7] 鄧立春，沈伟生，张瑶，等.化疗对晚期结直肠癌患者血清VEGF水平的影响[J].实用临床医药杂志，2010，14（3）：90-93.
（收稿日期：2017-10-11）
（修回日期：2017-11-26；编辑：华强）
关键词：补肾健脾方；结肠癌；血管内皮生长因子；基质金属蛋白酶7；BALB/c 裸鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.06.013
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）06-0053-03
Effects of Bushen Jianpi Prescription on Tumor Growth in Subcutaneous Colorectal Cancer Xenografts in Mice and Expressions of VEGF and MMP-7
WANG Yuan-hui1，2， FENG Yuan-yuan2， HAN Zhi-fen2， SUN Xiao-ting2， LIU Xuan2， DENG Wan-li2， LI Qi2
1. Jiangwan Hospital， Hongkou District， Shanghai 200434， China；
2. Shuguang Hospital， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China
Abstract： Objective To investigate the effects of Bushen Jianpi Prescription on tumor growth in subcutaneous colorectal cancer xenografts in mice and expressions of VEGF and MMP-7； To discuss its mechanism of anti-colon cancer. Methods Nude mice were inoculated subcutaneously into human colon cancer cells to establish human colon cancer xenograft models. Nude mouse models of subcutaneous colorectal cancer xenografts were randomly divided into model group， 5-FU group， Bushen Jianpi low-， medium-， and high-dose groups. Each medication group was given relevant medicine for three weeks. Six tumor-bearing mice in each group were sacrificed. Tumor mass was measured， and the relative inhibition rate was calculated. The serum levels of VEGF and MMP-7 were measured by ELISA. The remaining tumor-bearing mice were used to observe the survival time. Results Compared with model group， the weight of tumor were reduced and the median survival time of mice were prolonged in Bushen Jianpi groups， as well as the expression levels of VEGF and MMP-7 significantly decreased Bushen Jianpi groups. Conclusion Bushen Jianpi Prescription can inhibit the growth of human colon cancer xenografts in nude mice and prolong the survival time of tumor-bearing mice， which may be related to the down-regulation of the expressions of VEGF and MMP-7.
Keywords： Bushen Jianpi Prescription； colorectal cancer； VEGF； MMP-7； BALB/c nude mice
大腸癌目前治疗方法以手术切除、放化疗为主，但仍有高复发率、高转移率及高病死率的特点。中医药在防治肿瘤复发和转移有一定的疗效[1-2]。复方补肾健脾方是上海中医药大学附属曙光医院肿瘤科临床经验方，有益气补肾健脾、解毒消肿散结之功效，临床疗效较好[3]，但其机制尚不明确。本实验建立人结肠癌裸鼠皮下移植瘤模型，采用补肾健脾方进行干预，观察其对人结肠癌裸鼠移植瘤的作用，探讨其抗结肠癌的部分机制，为其临床应用提供依据。 1 实验材料
1.1 细胞株与动物
人结肠癌细胞株LoVo，上海博谷生物有限公司。雄性BALB/c裸鼠80只，SPF级，4～6周龄，体质量18～20 g，上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物许可证号SCXK（沪）2016-0019。饲养于上海中医药大学SPF级实验动物中心。
1.2 药物
补肾健脾方由黄芪、白术、女贞子、肉苁蓉、野葡萄藤、石见穿、八月札组成，其提取物由上海医药工业研究院制备及质量控制。
1.3 主要试剂与仪器
F12K培养基及胎牛血清，美国Gibco公司；5-氟尿嘧啶（5-FU），上海旭东海普药业有限公司；人血管内皮生长因子（VEGF）、人基质金属蛋白酶7（MMP-7）ELISA试剂盒，上海博谷生物科技有限公司。双人垂直流超净工作台（新加坡ESCO），台式低速离心机（德国Eppendorf），荧光倒置显微镜（日本OLMYPUS），CO2培养箱（英国RSBiotech）。
2 实验方法
2.1 细胞培养
F12K培养基（10%胎牛血清、1.5 g/L碳酸氢钠、1.5 mmol/L L-谷氨酰胺）培养人结肠癌LoVo细胞，置于37 ℃、饱和湿度、5%CO2孵箱。
2.2 人结肠癌裸鼠移植瘤模型建立
将人结肠癌LoVo细胞制成浓度为1×107/mL悬液。取3只BALB/c裸鼠，将细胞悬液接种于裸鼠背部近右上肢皮肤（其中一只双侧上肢皮肤），接种量0.2 mL/只。待瘤体生长直径达1～1.2 cm，选择肿瘤瘤体生长相对比较旺盛且无溃破荷瘤鼠作为供瘤鼠，剥取瘤体，去除坏死组织及纤维组织，选择肿瘤边缘相对比较新鲜的肿瘤组织，将其剪成约1 mm3，无菌环境将其接种到裸鼠右侧腋窝的皮下。按上述方法予以传代2代后，将肿瘤组织大量接种于裸鼠腋窝皮下，构建人结肠癌裸鼠皮下移植瘤模型。待肿瘤生长到体积约100～300 mm3，进行后续实验。
2.3 分组及给药
将动物随机分为模型组、5-FU组和补肾健脾方低剂量（BSJP-L）、中剂量（BSJP-M）、高剂量（BSJP-H）组，每组12只。BSJP-L组、BSJP-M组、BSJP-H组予补肾健脾方提取物250、500、1000 mg/（kg·d）灌胃，5-FU组每2 d腹腔注射5-FU 50 mg/kg，模型组予等体积生理盐水灌胃。给药体积均为5 mL/kg，连续3周。
2.4 检测指标
实验期间每隔1 d测量肿瘤直径并称定裸鼠体质量。给药3周后将每组6只裸鼠处死后摘除眼球并取血，收集血清，取出移植瘤瘤体，测量瘤体长、短径及质量，瘤体用福尔马林固定，石蜡包埋。计算肿瘤体积（TV=ab2/2，a、b分别表示肿瘤长、短径）和抑瘤率[（l-实验组平均瘤质量÷对照组平均瘤质量）×100%]。每组剩余6只裸鼠用于观察生存时间，计算生存延长率[（治疗组平均生存天数-对照组平均生存天数）÷对照组平均生存天数×100%]。
ELISA检测血清VEGF和MMP-7表达，严格按试剂盒说明书进行操作。
3 统计学方法
采用SPSS18.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，采用方差分析，组间比较用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 补肾健脾方对人结肠癌裸鼠移植瘤抑瘤率的影响
随给药时间延长，各组瘤体体积大小逐渐出现差距，各给药组瘤体质量小于模型组（P<0.05，P<0.01）；各给药组抑瘤率比较差异明显（P<0.01）。结果见表1。
4.2 补肾健脾方对荷瘤鼠生存时间的影响
各给药组荷瘤鼠中位生存时间较模型组明显延长（P<0.05，P<0.01），各给药组生存延长率比较差异有统计学意义（P<0.01）。结果见表2。
4.3 补肾健脾方对荷瘤鼠血清血管内皮生长因子和基质金属蛋白酶7表达的影响
各给药组VEGF、MMP-7表達较模型组明显下降（P<0.05，P<0.01），各给药组VEGF、MMP-7表达比较差异有统计学意义（P<0.01）。结果见表3。
5 讨论
大肠癌属中医学“肠溜”“肠澼”“积聚”等范畴。中医学认为，本虚标实是大肠癌的病机特点，本虚为脾肾亏虚，标实为湿热毒邪积聚。本课题组前期研究发现，大肠癌在脾虚湿热证的基础上，转移患者多伴有肾虚或者潜在肾虚的特征。因此，治法当以益气补肾健脾为主，兼顾解毒消肿散结。补肾健脾方中黄芪补气健脾，肉苁蓉、女贞子益肾，三者合用为君，以实补肾健脾之能；白术功主健脾益气，是以为臣；石见穿、野葡萄藤二者合用以主清热解毒、软坚散结之功，八月札功主理气，共行佐使之责。诸药集补脾、益肾、消结、化瘤之功效为一体。综观全方，药虽简，然力专甚，扶正不助邪，驱邪不伤正。本实验通过建立人结肠癌裸鼠皮下移植瘤模型，采用补肾健脾方进行干预，发现补肾健脾方可明显抑制人结肠癌裸鼠肿瘤的生长。进一步观察荷瘤鼠生存期，发现补肾健脾方可明显延长荷瘤鼠的生存时间。
肿瘤血管新生或血管生成是实体瘤生长非常关键的因素。恶性肿瘤的生长、浸润和转移有赖于肿瘤血管的生成，如无血管生成，原发肿瘤生长不会超过1～2 mm3，其继续生长必须依赖新血管的形成，以提供足够的营养和氧，带走代谢产物。同时新生血管管壁不完整，呈高通透状态，利于肿瘤细胞的转移。肿瘤血管生成受血管生成因子和血管生成抑制因子两者的有机调控：一旦血管生成因子上调或血管生成抑制因子功能障碍，二者平衡被打破即发生肿瘤血管新生[4-6]。VEGF是刺激肿瘤血管生成的最强的、特异性最高的促血管生长因子之一。当VEGF呈现高表达时，能明显刺激血管内皮细胞，使其快速增殖，进而介导大量血管的新生，从而为肿瘤组织的生长提供所必需的大量营养及能量，促进肿瘤细胞的侵袭和转移[7]。MMP-7在MMPs家族中与肿瘤的关系最为密切，是唯一在肿瘤细胞而非肿瘤间质表达的MMPs。当MMP-7被激活后，它不仅能通过促进血管内皮细胞的增殖来介导肿瘤新生血管的生成，还能通过抑制肿瘤细胞的凋亡来促进肿瘤细胞的生长。本实验采用ELISA检测补肾健脾方对裸鼠血清VEGF和MMP-7表达，结果显示，与模型组比较，补肾健脾方低、中、高剂量组VEGF、MMP-7表达明显下降。 综上，补肾健脾方能抑制裸鼠皮下移植瘤的生长，延长荷瘤鼠的生存时间，其机制可能与下调VEGF和MMP-7表达有关。
参考文献：
[1] TAN K Y， LIU C B， CHEN A H， et al. The role of traditional Chinese medicine in colorectal cancer treatment[J]. Tech Coloproctol， 2008，12（1）：1-6.
[2] CHANG K H， BRODIE R， CHOONG M A， et al. Complementary and alternative medicine use in oncology：a questionnaire survey of patients and health care professionals[J]. BMC Cancer，2011，11：196.
[3] 张彦博，刘宣，季青，等.健脾解毒方联合化疗治疗转移性结直肠癌临床研究[J].中华中医药杂志，2015，30（6）：2090-2093.
[4] FOLKMAN J. Clinical applications of research on angiogenesis：seminars in medicine of the Beth Israel Hospital[J]. N Engl J Med，1995，333（26）：1757.
[5] THOMPSON W D，LIW W，MARAGOUDAKIS M. The clinical manipulation of angiogenesis：pathology， side-effects， surprises， and opportunities with novel human therapies[J]. J Pathol，2000， 190（3）：330.
[6] KAWASAKI T， NOSHO K， OHNISHI M， et al. Correlation of beta- catenin localization with cyclooxygenase-2 expression and CpG island methylator phenotype （CIMP） in colorectal cancer[J]. Neoplasia，2007，9（7）：569.
[7] 鄧立春，沈伟生，张瑶，等.化疗对晚期结直肠癌患者血清VEGF水平的影响[J].实用临床医药杂志，2010，14（3）：90-93.
（收稿日期：2017-10-11）
（修回日期：2017-11-26；编辑：华强）