【摘 要】
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目的:利用酵母Pichia pastoris 蛋白表达系统,表达准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白。方法:根据新疆准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白(MPAFP5)基因序列设计引物,并分别在5’引物和3’引物中引入
【机 构】
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新疆大学生命科学与技术学院分子生物学重点实验室
【基金项目】
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科技部重大基础研究前期专项(“新疆荒漠昆虫抗冻蛋白基因克隆及其对葡萄转化的研究”;2003CCA1000)
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目的:利用酵母Pichia pastoris 蛋白表达系统,表达准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白。方法:根据新疆准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白(MPAFP5)基因序列设计引物,并分别在5’引物和3’引物中引入了EcoRI和SalI酶切位点,经PCR扩增MPAFP5基因成熟肽序列后与pGEX4T-1载体相连,再将MPAFP5从pGEX4T-1 载体上切下亚克隆至穿梭质粒pGAPZαA上,获得的重组穿梭质粒pGAPZαA-MPAFP5,经线性化后采用电转化法将重组穿梭质粒转入酵母细胞SMD1168内,Zeocin+筛选鉴定重组子,小瓶发酵后取上清作SDS-PAGE检测,并用Western-blot检测表达蛋白的正确性。结果:MPAFP5成功地在酵母表达系统获得表达,Western-blot检测表明表达产物为准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白。结论:酵母表达系统能够高效表达准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白,为高密度发酵大量生产抗冻蛋白奠定了基础。
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