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广东省中医药局课题：姜黄素对宫颈癌放射增敏作用的体内实验研究 项目编号20141229
摘要：目的：本文主要针对姜黄素，研究其对Hela细胞通过株放疗而产生增敏作用与作用机制进行探讨。方法：取生长期对数宫颈癌Hela细胞行宫颈癌Hela细胞培养，设置宫颈癌Hela细胞照射条件 用6MV Clinac 600C/D加速器在室温下照射。读取宫颈癌Hela细胞计数 并采用MTT法对姜黄毒的辐射敏感性测定。结果： 当辐射剂量大于12Gy时，观察细胞增殖抑制率，结果示不再随作用时间的延长和射线剂量的加大而增加，达坪值，对12Gy剂量射线加不同浓度姜黄素于Hela细胞作用的结果选取，显示出随药物浓度的增加，细胞增殖抑制率可有升高，当浓度>12μmol/L时，曲线呈平坦状。药物加辐射后，相较单纯辐射或单纯药物组，24h细胞增殖抑制率均有差异（见图1）。可能为临床常规放疗剂量，及姜黄素同时具杀伤细胞作用，为防两者联合加大细胞杀伤程度，故对4Gy射线剂量加姜黄素25μmol/L选择，行后续增敏试验研究。结论：用MTT法对姜黄素及射线对宫颈癌细胞的抑制作用分别检测，最佳的姜黄素工作浓度为25μmol/L，射线最佳工作剂量为4Gy，证实姜黄素对宫颈癌Hela细胞有放疗增敏作用。而能对此病的医治提供有效的治疗方法，使得康复率更高，推动医学的发展。
关键词：姜黄素;宫颈癌 ;Hela细胞 ;株放疗 ;增敏作用
姜黄素指的是一种色素，其主要是从姜科植物（如郁金，姜黄，莪术等）和天南星科植物（如菖蒲等）中提取的。经研究证明，发现姜黄素不仅能为一些食品着色和作酸碱指示剂，在医学上还能够医治炎症，具有抗氧化和抗类风湿的作用，除此之外，还具有降血脂，抗肿瘤，利胆等作用。并且美国VITY维他命杂志的报道也证实了这样的说法，报道称：“姜黄素的主要药理作用有抗氧化、抗炎、抗凝、降脂、抗动脉粥样硬化、抗衰老消除自由基及抑制肿瘤生长等。”2006年11月，美国《关节炎与风湿病》期刊一篇文章也指出：“姜黄素可以防止关节肿大、关节炎，对心血管疾病、癌症等有效”。由于姜黄素本身的抗氧化性，它可以选择性的抑制蛋白酪氨基酸酶和血小板来源的生长因子受体，从而能抑制细胞的无序增殖，并且使其凋亡，从而达到抵抗肿瘤细胞的目的，其抗癌作用，在临床医学的应用上十分广泛。本文就对宫颈癌Hela细胞株放疗增敏的作用及机制展开探讨，现总结结果如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 以人宫颈癌HeLa细胞株为实验细胞，实验试剂为姜黄素粉剂，将其在二甲基亚砜（DMSO）溶液溶解，制成姜黄素母液，为1mg/ml，于-20度冰箱储存备用，用含10%新生牛血清的RPMI-1640培养液稀释达所需浓度。
1.2 方法
1.2.1宫颈癌Hela细胞培养 （1）取生长期对数宫颈癌Hela细胞，将培养瓶内的培养液吸出弃掉，取PBS清洗悬浮细胞适量加入，将PBS用刻度吸管吸出弃掉。（2）取0.25%胰酶适量加入消化，显微镜下对细胞形态变化观察，当宫颈癌Hela细胞的胞体变圆，间隙变大时，将胰酶吸出，取10%RPMI-1640培养液适量加入对消化终止。（3）取无菌弯头吸管对细胞小心吹打，制成单细胞悬液，取适量在另一培养瓶中接种。
1.2.2 宫颈癌Hela细胞照射条件 用6MV Clinac 600C/D加速器在室温下照射。
1.2.3 宫颈癌Hela细胞计数 选取于培养瓶底部均匀铺满的一瓶细胞，行PBS清洗，取0.25%胰酶适量进行消化，将胰酶吸出，加入培养液终止消化，制成单细胞悬液备用，将计数板于低倍镜下放置观察并计数。观察放射线对宫颈癌Hela细胞增殖产生的影响。掌握姜黄素对宫颈癌Hela细胞产生的细胞毒性。采用MTT法对姜黄毒的辐射敏感性测定。
1.3 统计学方法 所有数据同规格采用SPSS10.0软件处理，组间比较采用X2检验，具有差异统计（P<0.05）。
2 结果
当辐射剂量大于12Gy时，观察细胞增殖抑制率，结果示不再随作用时间的延长和射线剂量的加大而增加，达坪值，对12Gy剂量射线加不同浓度姜黄素于Hela细胞作用的结果选取，显示出随药物浓度的增加，细胞增殖抑制率可有升高，当浓度>12μmol/L时，曲线呈平坦状。药物加辐射后，相较单纯辐射或单纯药物组，24h细胞增殖抑制率均有差异（见图1）。可能为临床常规放疗剂量，及姜黄素同时具杀伤细胞作用，为防两者联合加大细胞杀伤程度，故对4Gy射线剂量加姜黄素25μmol/L选择，行后续增敏试验研究。
图1 宫颈癌细胞增殖受姜黄素联合射线的影响
表1两组疗效及治疗时间对比
注：与对照组比较，研究组（姜黄素）效果明显
3讨论
在古籍中，对于姜黄素有诸多药理介绍，如在《本草纲目》中记载：“郁金入心，专治血分之病;姜黄入脾，兼治血中之气;莪术入肝，治气中之血。”等等，在《黄帝内经》和《千金方》中也有类似记载，阐述了姜黄素的药理作用以及对于治理此病的利处，通过这些论证，可以看出来在很早以前人们就有相对应的办法，可是在科技并不发展的古代，我们不否认中医的博大精深，但要是让一个初学者去明白其中的原理那就变得不十分清晰了。对此，下面我们就来详细谈谈关于姜黄素对于宫颈癌Hela细胞株的作用。
宫颈癌Hela细胞是一种癌细胞吗，具有癌细胞所具有的功能，能无限繁殖。而对于姜黄素，它能抑制癌细胞在第一次分裂周期中后期纺锤体的形成，能够促进促凋亡基因蛋白表达增加，凋亡抑制基因蛋白表达减少，从而使得翻译出来的蛋白质促进癌细胞在G2/M期不能进行继续分裂增殖，加速癌细胞凋亡。对于宫颈癌细胞，姜黄素能通过控制线粒体膜电位（三价的铁离子还原为亚铁例子，硫醇基被氧化产生羟基，增加细胞膜的通透性，从而促进癌细胞的凋亡）和BCL-2蛋白的翻译表达，增加Bax蛋白表达，激活C-3酶的活性，控制癌细胞膜的通透性，抑制癌细胞的分裂增殖，促进其凋亡。 姜黄素对于宫颈癌Heal细胞的增敏作用还体现在，姜黄素能抑制癌细胞的扩散。以胃癌细胞为例，姜黄素能通过控制Ets-1基因的翻译表达来控制宫颈癌Hela细胞的扩散。经医学研究发现，当Ets-1基因表达蛋白质减少时，机体内的绒癌细胞扩散以及对于其他正常细胞粘附力也下降。在现代医疗水平的前提下，癌症患者在进行治疗时，我们不可避免的要用到化疗，而在化疗过程中，当你长期使用一种药物时，并不能起到预期多需要的效果，所以迫使医生和患者不得不采取其他的药物治疗，这样就会浪费很大的人力物力和财力。经研究证明发现，姜黄素能改变宫颈癌Hela细胞的耐药性，以淋巴癌为例，姜黄素主要通过降低survivin，MDR1mRNA和survivin、P-gp蛋白质的翻译表达控制癌细胞的耐药性。上述以胃癌细胞和淋巴癌细胞为例，我们可以证明姜黄素的药用性质，所以姜黄素对于宫颈癌Hela细胞株的抑制扩散和改变其耐药性的增敏作用可以另作一课题进行深入研究。
上述关于姜黄素的药理分析和医学证明，可以作为关于姜黄素对宫颈癌Hela细胞株作高效放疗增敏剂的理论依据。经研究发现，对于姜黄素处理癌细胞的最适宜浓度是25umol/L。在临床医学上，对于宫颈癌中晚期的患者，采取最多的就是放疗，因为放疗能最快速度的杀死部分的癌变细胞，同时也产生很大的副作用，对身体的其他正常生理功能产生很大的影响，使其不能正常工作，造成患者的痛苦。所以，能用最直接有效而且不伤害患者的前提下的方法是医生和患者都喜闻乐见的，那么对于有效的增敏剂的研究就变得尤为关键。在很早以前，临床试验就采取了很多办法，也获得了一些显著的成功，但并不能满足人们的需求，对于姜黄素的研究与发现，不论是其药理作用还是其产生的功能等等，都能满足人们的需求，而且被国内外认可。除此之外，在很早以前，姜黄素就已经被作为是一种色素被运用到食品行业中。
对于姜黄素，它本身的药理和医学功能，除了被我们认可外，我们都希望姜黄素能以其更好地效果投入到临床医学中，为医学发展做出更大的进步。而且在临床医学中，除姜黄素外，或许还有很多我们未发现的天然产物能为我们的医学治疗提供更加有效的治疗方法。中华文化的博大精深和源远流长，在很多医学名著中，不论是《黄帝内经》还是《千金方》，都为我们的医学理论提供了强而有力的证据，也为我们的医学发展奠定了坚实的基础。与本次研究结果示，采用MTT法对姜黄素及射线对宫颈癌细胞的抑制作用分别检测，最佳的姜黄素工作浓度为
射线最佳工作剂量为4Gy，证实姜黄素对宫颈癌Hela细胞有放疗增敏作用。
参考文献：
[1]张莉. 姜黄素对宫颈癌Hela细胞株放疗增敏的作用及其机制研究[D].湖北中医药大学，2013.
[2]佐志刚. 槲皮素对宫颈癌Hela细胞放疗增敏及抑制转移的作用研究[D].湖北中医药大学，2014.
[3]赵琳. 四环素衍生物CMT-3抗癌作用及其机制的研究[D].苏州大学，2014.
[4]Liu D，Zhou P，Zhang L，Wu G，Zheng Y，He F Differential expression of Oct4 in HPV-positive and HPV-negavite cervical cancer cells is not regulated by DNA methyltrasferase 3A.Tumour Biol.
摘要：目的：本文主要针对姜黄素，研究其对Hela细胞通过株放疗而产生增敏作用与作用机制进行探讨。方法：取生长期对数宫颈癌Hela细胞行宫颈癌Hela细胞培养，设置宫颈癌Hela细胞照射条件 用6MV Clinac 600C/D加速器在室温下照射。读取宫颈癌Hela细胞计数 并采用MTT法对姜黄毒的辐射敏感性测定。结果： 当辐射剂量大于12Gy时，观察细胞增殖抑制率，结果示不再随作用时间的延长和射线剂量的加大而增加，达坪值，对12Gy剂量射线加不同浓度姜黄素于Hela细胞作用的结果选取，显示出随药物浓度的增加，细胞增殖抑制率可有升高，当浓度>12μmol/L时，曲线呈平坦状。药物加辐射后，相较单纯辐射或单纯药物组，24h细胞增殖抑制率均有差异（见图1）。可能为临床常规放疗剂量，及姜黄素同时具杀伤细胞作用，为防两者联合加大细胞杀伤程度，故对4Gy射线剂量加姜黄素25μmol/L选择，行后续增敏试验研究。结论：用MTT法对姜黄素及射线对宫颈癌细胞的抑制作用分别检测，最佳的姜黄素工作浓度为25μmol/L，射线最佳工作剂量为4Gy，证实姜黄素对宫颈癌Hela细胞有放疗增敏作用。而能对此病的医治提供有效的治疗方法，使得康复率更高，推动医学的发展。
关键词：姜黄素;宫颈癌 ;Hela细胞 ;株放疗 ;增敏作用
姜黄素指的是一种色素，其主要是从姜科植物（如郁金，姜黄，莪术等）和天南星科植物（如菖蒲等）中提取的。经研究证明，发现姜黄素不仅能为一些食品着色和作酸碱指示剂，在医学上还能够医治炎症，具有抗氧化和抗类风湿的作用，除此之外，还具有降血脂，抗肿瘤，利胆等作用。并且美国VITY维他命杂志的报道也证实了这样的说法，报道称：“姜黄素的主要药理作用有抗氧化、抗炎、抗凝、降脂、抗动脉粥样硬化、抗衰老消除自由基及抑制肿瘤生长等。”2006年11月，美国《关节炎与风湿病》期刊一篇文章也指出：“姜黄素可以防止关节肿大、关节炎，对心血管疾病、癌症等有效”。由于姜黄素本身的抗氧化性，它可以选择性的抑制蛋白酪氨基酸酶和血小板来源的生长因子受体，从而能抑制细胞的无序增殖，并且使其凋亡，从而达到抵抗肿瘤细胞的目的，其抗癌作用，在临床医学的应用上十分广泛。本文就对宫颈癌Hela细胞株放疗增敏的作用及机制展开探讨，现总结结果如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 以人宫颈癌HeLa细胞株为实验细胞，实验试剂为姜黄素粉剂，将其在二甲基亚砜（DMSO）溶液溶解，制成姜黄素母液，为1mg/ml，于-20度冰箱储存备用，用含10%新生牛血清的RPMI-1640培养液稀释达所需浓度。
1.2 方法
1.2.1宫颈癌Hela细胞培养 （1）取生长期对数宫颈癌Hela细胞，将培养瓶内的培养液吸出弃掉，取PBS清洗悬浮细胞适量加入，将PBS用刻度吸管吸出弃掉。（2）取0.25%胰酶适量加入消化，显微镜下对细胞形态变化观察，当宫颈癌Hela细胞的胞体变圆，间隙变大时，将胰酶吸出，取10%RPMI-1640培养液适量加入对消化终止。（3）取无菌弯头吸管对细胞小心吹打，制成单细胞悬液，取适量在另一培养瓶中接种。
1.2.2 宫颈癌Hela细胞照射条件 用6MV Clinac 600C/D加速器在室温下照射。
1.2.3 宫颈癌Hela细胞计数 选取于培养瓶底部均匀铺满的一瓶细胞，行PBS清洗，取0.25%胰酶适量进行消化，将胰酶吸出，加入培养液终止消化，制成单细胞悬液备用，将计数板于低倍镜下放置观察并计数。观察放射线对宫颈癌Hela细胞增殖产生的影响。掌握姜黄素对宫颈癌Hela细胞产生的细胞毒性。采用MTT法对姜黄毒的辐射敏感性测定。
1.3 统计学方法 所有数据同规格采用SPSS10.0软件处理，组间比较采用X2检验，具有差异统计（P<0.05）。
2 结果
当辐射剂量大于12Gy时，观察细胞增殖抑制率，结果示不再随作用时间的延长和射线剂量的加大而增加，达坪值，对12Gy剂量射线加不同浓度姜黄素于Hela细胞作用的结果选取，显示出随药物浓度的增加，细胞增殖抑制率可有升高，当浓度>12μmol/L时，曲线呈平坦状。药物加辐射后，相较单纯辐射或单纯药物组，24h细胞增殖抑制率均有差异（见图1）。可能为临床常规放疗剂量，及姜黄素同时具杀伤细胞作用，为防两者联合加大细胞杀伤程度，故对4Gy射线剂量加姜黄素25μmol/L选择，行后续增敏试验研究。
图1 宫颈癌细胞增殖受姜黄素联合射线的影响
表1两组疗效及治疗时间对比
注：与对照组比较，研究组（姜黄素）效果明显
3讨论
在古籍中，对于姜黄素有诸多药理介绍，如在《本草纲目》中记载：“郁金入心，专治血分之病;姜黄入脾，兼治血中之气;莪术入肝，治气中之血。”等等，在《黄帝内经》和《千金方》中也有类似记载，阐述了姜黄素的药理作用以及对于治理此病的利处，通过这些论证，可以看出来在很早以前人们就有相对应的办法，可是在科技并不发展的古代，我们不否认中医的博大精深，但要是让一个初学者去明白其中的原理那就变得不十分清晰了。对此，下面我们就来详细谈谈关于姜黄素对于宫颈癌Hela细胞株的作用。
宫颈癌Hela细胞是一种癌细胞吗，具有癌细胞所具有的功能，能无限繁殖。而对于姜黄素，它能抑制癌细胞在第一次分裂周期中后期纺锤体的形成，能够促进促凋亡基因蛋白表达增加，凋亡抑制基因蛋白表达减少，从而使得翻译出来的蛋白质促进癌细胞在G2/M期不能进行继续分裂增殖，加速癌细胞凋亡。对于宫颈癌细胞，姜黄素能通过控制线粒体膜电位（三价的铁离子还原为亚铁例子，硫醇基被氧化产生羟基，增加细胞膜的通透性，从而促进癌细胞的凋亡）和BCL-2蛋白的翻译表达，增加Bax蛋白表达，激活C-3酶的活性，控制癌细胞膜的通透性，抑制癌细胞的分裂增殖，促进其凋亡。 姜黄素对于宫颈癌Heal细胞的增敏作用还体现在，姜黄素能抑制癌细胞的扩散。以胃癌细胞为例，姜黄素能通过控制Ets-1基因的翻译表达来控制宫颈癌Hela细胞的扩散。经医学研究发现，当Ets-1基因表达蛋白质减少时，机体内的绒癌细胞扩散以及对于其他正常细胞粘附力也下降。在现代医疗水平的前提下，癌症患者在进行治疗时，我们不可避免的要用到化疗，而在化疗过程中，当你长期使用一种药物时，并不能起到预期多需要的效果，所以迫使医生和患者不得不采取其他的药物治疗，这样就会浪费很大的人力物力和财力。经研究证明发现，姜黄素能改变宫颈癌Hela细胞的耐药性，以淋巴癌为例，姜黄素主要通过降低survivin，MDR1mRNA和survivin、P-gp蛋白质的翻译表达控制癌细胞的耐药性。上述以胃癌细胞和淋巴癌细胞为例，我们可以证明姜黄素的药用性质，所以姜黄素对于宫颈癌Hela细胞株的抑制扩散和改变其耐药性的增敏作用可以另作一课题进行深入研究。
上述关于姜黄素的药理分析和医学证明，可以作为关于姜黄素对宫颈癌Hela细胞株作高效放疗增敏剂的理论依据。经研究发现，对于姜黄素处理癌细胞的最适宜浓度是25umol/L。在临床医学上，对于宫颈癌中晚期的患者，采取最多的就是放疗，因为放疗能最快速度的杀死部分的癌变细胞，同时也产生很大的副作用，对身体的其他正常生理功能产生很大的影响，使其不能正常工作，造成患者的痛苦。所以，能用最直接有效而且不伤害患者的前提下的方法是医生和患者都喜闻乐见的，那么对于有效的增敏剂的研究就变得尤为关键。在很早以前，临床试验就采取了很多办法，也获得了一些显著的成功，但并不能满足人们的需求，对于姜黄素的研究与发现，不论是其药理作用还是其产生的功能等等，都能满足人们的需求，而且被国内外认可。除此之外，在很早以前，姜黄素就已经被作为是一种色素被运用到食品行业中。
对于姜黄素，它本身的药理和医学功能，除了被我们认可外，我们都希望姜黄素能以其更好地效果投入到临床医学中，为医学发展做出更大的进步。而且在临床医学中，除姜黄素外，或许还有很多我们未发现的天然产物能为我们的医学治疗提供更加有效的治疗方法。中华文化的博大精深和源远流长，在很多医学名著中，不论是《黄帝内经》还是《千金方》，都为我们的医学理论提供了强而有力的证据，也为我们的医学发展奠定了坚实的基础。与本次研究结果示，采用MTT法对姜黄素及射线对宫颈癌细胞的抑制作用分别检测，最佳的姜黄素工作浓度为
射线最佳工作剂量为4Gy，证实姜黄素对宫颈癌Hela细胞有放疗增敏作用。
参考文献：
[1]张莉. 姜黄素对宫颈癌Hela细胞株放疗增敏的作用及其机制研究[D].湖北中医药大学，2013.
[2]佐志刚. 槲皮素对宫颈癌Hela细胞放疗增敏及抑制转移的作用研究[D].湖北中医药大学，2014.
[3]赵琳. 四环素衍生物CMT-3抗癌作用及其机制的研究[D].苏州大学，2014.
[4]Liu D，Zhou P，Zhang L，Wu G，Zheng Y，He F Differential expression of Oct4 in HPV-positive and HPV-negavite cervical cancer cells is not regulated by DNA methyltrasferase 3A.Tumour Biol.