【摘 要】
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目的 构建Flp/FRT位点特异重组系统介导的致死型约氏疟原虫基因条件修饰体系,用于疟原虫红前期基因功能的研究. 方法 构建含有Flp酶基因序列和FRT标记耐药基因的重组质粒,通
【机 构】
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济宁医学院精准医学研究院,山东济宁272067;济宁医学院临床医学院;中国医科大学基础医学院病原生物学教研室;济宁医学院基础医学院病原生物学教研室
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目的 构建Flp/FRT位点特异重组系统介导的致死型约氏疟原虫基因条件修饰体系,用于疟原虫红前期基因功能的研究. 方法 构建含有Flp酶基因序列和FRT标记耐药基因的重组质粒,通过Nucleofector电转技术将线性化质粒转染至约氏疟原虫P.yoelii 17XL.经药物筛选并克隆后,利用PCR和核酸探针杂交进行基因型鉴定.经蚊体内发育,启动Flp酶介导的位点特异重组去除药物筛选基因(hDHFR),并利用PCR技术分析基因工程疟原虫内Flp酶介导的FRT位点间的重组效率.通过检测感染小鼠的发病情况、疟疾血症及生存曲线分析基因工程疟原虫的生物学特性. 结果 成功构建打靶载体pyUIS4/Flp并重组至UIS4基因的5'调控区,获同源重组疟原虫P.yUIS4/Flp(R),经蚊体内发育获位点特异重组删除药物筛选基因的基因工程疟原虫P.yUIS4/Flp.PCR和核酸探针鉴定基因工程疟原虫基因型正确.基因工程疟原虫内Flp酶介导的FRT位点间的重组在发育至14d的子孢子内达到近100％的重组效率.与野生型疟原虫比较,小鼠感染后3d镜下均查见感染红细胞,其内疟原虫形态未见异常,7d红细胞寄生率达峰值,分别为80.5％和82.7％,疟疾血症及生存曲线均无统计学差异(P＞0.05). 结论 成功构建基因工程疟原虫P.yUIS4/Flp,其生物学特性与野生型疟原虫无明显不同,并具有较高的位点特异的重组效率,可用于疟原虫红前期基因功能的研究及减毒活疫苗的研制.
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