【摘 要】
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目的 katG基因表达异常对一线抗痨药物异烟肼的耐药性意义重大,克隆并表达结核分枝杆菌katG基因的调控蛋白—furA、katG、senX3和regX3,有助于探讨其耐药机制.方法 以结核分
【机 构】
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贵州省疾病预防控制中心结核病防治研究所,贵阳550004;贵州中医药大学附属二院
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目的 katG基因表达异常对一线抗痨药物异烟肼的耐药性意义重大,克隆并表达结核分枝杆菌katG基因的调控蛋白—furA、katG、senX3和regX3,有助于探讨其耐药机制.方法 以结核分枝杆菌标准菌株H37Rv基因组DNA序列为模板,设计furA、katG、senX3和regX3四种基因的特异性引物,分别进行PCR扩增,获得目的基因,通过克隆载体pMD19-T构建重组质粒,转化EcoliDH5α,经DNA测序并与Gen Bank进行比对分析验证,质粒酶切后再亚克隆到表达载体pET42a(+),转化BL21(DE3)中,IPTG诱导重组目的蛋白表达,SDS-PAGE电泳分析重组蛋白大小,Western Blot鉴定表达情况.结果 PCR扩增出furA、katG、senX3和regX3基因,成功构建重组质粒pET42a(+)-furA、pET42a(+)-katG、pET42a(+)-senX3、pET42a(+)-regX3,0.5 mmol/L IPTG 诱导表达重组蛋白,经 SDS-PAGE 电泳和 Western Blot 验证,furA重组蛋白在23KD、regX3重组蛋白在28KD、senX3重组蛋白在46 KD和katG重组蛋白在80 KD处分别出现蛋白条带,重组蛋白主要以可溶形式表达.结论 应用分子生物学技术成功构建furA、katG、senX3和regX3基因原核表达系统,并获得相应重组蛋白,为进一步研究其结构和功能,探讨以katG为核心的异烟肼耐药机制奠定基础.
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