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摘要 为了缩短奶水牛的产犊间隔，提高繁殖效率和养殖效益，利用酶联免疫反应原理采用一种快速可视孕检试剂盒对配种后28 d以上的试验母牛进行检测。对429例已配种母牛进行检测，其中阴性（空怀）265例，阳性（怀孕）164例，验证检查阴性265例，阳性160例，试剂盒检测的阴性准确率为100%，阳性准确率为97.56%，可见该试剂盒可用于水牛的早期孕检。
关键词 奶水牛;早期孕检;酶联免疫反应试剂盒;产犊间隔
中图分类号 S823.3 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）17-0098-02
Abstract In order to shorten the calving interval of dairy buffalo and improve the efficiency of breeding and raising efficiency，we used enzymelinked immune reaction principle， adopted a quick and visual pregnancy test kit to make early pregnancy test on experimental cows more than 28 days after mating. 429 cases of mated cows were detected， the results showed that 265 cows were negative （empty），164 cows were positive （pregnant）， and 265 cows were negative by validation check and 160 cows were positive by validation check. The negative accuracy was 100% and the positive accuracy was 97.56% by ELISA kit. Therefore， this kit was suitable for early pregnancy test of buffalo.
Key words Dairy buffalo;Early pregnancy test;ELISA kit;Calving interval
及早对配种母牛进行准确的怀孕检查，可以查找出尚未怀孕的牛，方便观察和重配空怀奶牛，以缩短产犊间隔、减少无效饲养，从而提高养殖效益。国内外开展的早期妊娠诊断研究很多，主要包括外部觀察法、直肠检查法、超声波扫描和实验室检查（阴道黏液、尿液、乳汁、血液）等，其中直肠触诊和B超诊断在生产上应用较多，而实验室检查方法比较繁琐，准确性也偏低，在生产上应用较少。在实验室检测方面，Butler等[1]从牛胎盘提取物中首次发现妊娠特异性蛋白质B（pregnancy specific protein B，PSP-B）;Zoli等[2]采用相同方法从牛胎盘组织中完全分离出妊娠相关糖蛋白（pregnancyassociated glycoprotein，PAG），后来证实PAG即为PSP-B。此后，人们对PAG的分子结构和作用机制进行了深入研究，发现PAG主要来源于胎盘，是胎盘功能的标志，并在妊娠过程中起着免疫保护作用，它可以进入母体的外周血液循环，为早期妊娠诊断开辟新的途径并进行商业开发。“IDEXX”（爱德士）牛快速可视孕检试剂盒通过检测外周血液中PAG，配种后28 d就可以判断牛是否怀孕。笔者利用酶联免疫反应原理采用一种快速可视孕检试剂盒对配种后28 d以上的试验母牛进行了检测。
1 材料与方法
1.1 试验地点 试验在广西6个奶水场和1个奶水牛养殖大县进行。
1.2 试验对象与试剂
试验对象为产后60 d 以上且配种28 d 以上的奶水牛，检测的水牛品种包括摩拉水牛、尼里/拉菲水牛、地中海水牛3种河流型水牛以及3个品种与我国沼泽型水牛杂交的后代。
检测物为全血或血清，试剂为中美合作北京爱德士元享生物科技有限公司提供的“IDEXX”牛快速可视孕检试剂盒。
检测前所有的试剂盒组分从冷藏状态下复温至18～26 ℃。将试剂轻轻旋转，使其混合均匀，检测不同样品时需要更换吸头。
试验牛颈部或尾根静脉采血3～5 mL，使用血清时 3 500 r/min离心4 min后，分离血清。
1.3 检测方法 ①用移液器分别吸取100 μL的阴性对照和阳性对照加入到标记好的反应孔中。
②逐头吸取等量被检样品加入到不同的反应孔中。
③在每个反应孔中加入3滴试剂1（检测溶液）。
④盖上盖板，轻弹微量反应板10次加以混匀，18～26 ℃下孵育7 min。
⑤孵育完成后，移除板盖，快速翻转反应板，将板孔内液体放入废液缸（或水槽）并用力甩板，使板孔内液体流出。
⑥将每个反应孔加满双蒸水或去离子水，进行彻底洗板，确保每个反应孔能被彻底清洗，并保证洗液充满每一个反应孔。每次洗板后快速翻转反应板，弃去洗液，重复2次。在最后一次甩板后，将反应板用力在吸水纸上拍干，确保每一个反应孔中没有残留的洗液并清除气泡。
⑦在每个反应孔中加入3滴试剂2（酶标抗体），盖上盖板，轻弹微量反应板10次使其混匀，在18～26 ℃下孵育7 min。
⑧重复步骤⑤和⑥。
⑨在每个反应孔加入3滴试剂3（TMB底物溶液），盖上盖板，轻弹微量反应板10次使其混匀，在18～26 ℃下孵育7 min。
⑩在每个反应孔中加入3滴试剂4（终止液），轻弹微量反应板10次使其混匀。
关键词 奶水牛;早期孕检;酶联免疫反应试剂盒;产犊间隔
中图分类号 S823.3 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）17-0098-02
Abstract In order to shorten the calving interval of dairy buffalo and improve the efficiency of breeding and raising efficiency，we used enzymelinked immune reaction principle， adopted a quick and visual pregnancy test kit to make early pregnancy test on experimental cows more than 28 days after mating. 429 cases of mated cows were detected， the results showed that 265 cows were negative （empty），164 cows were positive （pregnant）， and 265 cows were negative by validation check and 160 cows were positive by validation check. The negative accuracy was 100% and the positive accuracy was 97.56% by ELISA kit. Therefore， this kit was suitable for early pregnancy test of buffalo.
Key words Dairy buffalo;Early pregnancy test;ELISA kit;Calving interval
及早对配种母牛进行准确的怀孕检查，可以查找出尚未怀孕的牛，方便观察和重配空怀奶牛，以缩短产犊间隔、减少无效饲养，从而提高养殖效益。国内外开展的早期妊娠诊断研究很多，主要包括外部觀察法、直肠检查法、超声波扫描和实验室检查（阴道黏液、尿液、乳汁、血液）等，其中直肠触诊和B超诊断在生产上应用较多，而实验室检查方法比较繁琐，准确性也偏低，在生产上应用较少。在实验室检测方面，Butler等[1]从牛胎盘提取物中首次发现妊娠特异性蛋白质B（pregnancy specific protein B，PSP-B）;Zoli等[2]采用相同方法从牛胎盘组织中完全分离出妊娠相关糖蛋白（pregnancyassociated glycoprotein，PAG），后来证实PAG即为PSP-B。此后，人们对PAG的分子结构和作用机制进行了深入研究，发现PAG主要来源于胎盘，是胎盘功能的标志，并在妊娠过程中起着免疫保护作用，它可以进入母体的外周血液循环，为早期妊娠诊断开辟新的途径并进行商业开发。“IDEXX”（爱德士）牛快速可视孕检试剂盒通过检测外周血液中PAG，配种后28 d就可以判断牛是否怀孕。笔者利用酶联免疫反应原理采用一种快速可视孕检试剂盒对配种后28 d以上的试验母牛进行了检测。
1 材料与方法
1.1 试验地点 试验在广西6个奶水场和1个奶水牛养殖大县进行。
1.2 试验对象与试剂
试验对象为产后60 d 以上且配种28 d 以上的奶水牛，检测的水牛品种包括摩拉水牛、尼里/拉菲水牛、地中海水牛3种河流型水牛以及3个品种与我国沼泽型水牛杂交的后代。
检测物为全血或血清，试剂为中美合作北京爱德士元享生物科技有限公司提供的“IDEXX”牛快速可视孕检试剂盒。
检测前所有的试剂盒组分从冷藏状态下复温至18～26 ℃。将试剂轻轻旋转，使其混合均匀，检测不同样品时需要更换吸头。
试验牛颈部或尾根静脉采血3～5 mL，使用血清时 3 500 r/min离心4 min后，分离血清。
1.3 检测方法 ①用移液器分别吸取100 μL的阴性对照和阳性对照加入到标记好的反应孔中。
②逐头吸取等量被检样品加入到不同的反应孔中。
③在每个反应孔中加入3滴试剂1（检测溶液）。
④盖上盖板，轻弹微量反应板10次加以混匀，18～26 ℃下孵育7 min。
⑤孵育完成后，移除板盖，快速翻转反应板，将板孔内液体放入废液缸（或水槽）并用力甩板，使板孔内液体流出。
⑥将每个反应孔加满双蒸水或去离子水，进行彻底洗板，确保每个反应孔能被彻底清洗，并保证洗液充满每一个反应孔。每次洗板后快速翻转反应板，弃去洗液，重复2次。在最后一次甩板后，将反应板用力在吸水纸上拍干，确保每一个反应孔中没有残留的洗液并清除气泡。
⑦在每个反应孔中加入3滴试剂2（酶标抗体），盖上盖板，轻弹微量反应板10次使其混匀，在18～26 ℃下孵育7 min。
⑧重复步骤⑤和⑥。
⑨在每个反应孔加入3滴试剂3（TMB底物溶液），盖上盖板，轻弹微量反应板10次使其混匀，在18～26 ℃下孵育7 min。
⑩在每个反应孔中加入3滴试剂4（终止液），轻弹微量反应板10次使其混匀。