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摘 要：东莨菪内酯作为一种天然香豆素类化合物，是一种天然的具有明显的抗炎、祛风、止痛和祛痰等功能的物质，被广泛应用于医药保健等领域。研究发现，青蒿中也存在东莨菪内酯。我国是青蒿比较丰富的国家，因此研究从青蒿中提取东莨菪内酯，从资源利用角度和经济方面具有重要意义。
本文在超声提取青蒿中东莨菪内酯的过程中，建立了以超声时间、超声温度、溶剂浓度以及料液比四个单因素为基础，进行了4因素3水平的正交试验设计与综合分析，并利用高效液相色谱法对最佳工艺条件下提取青蒿中东莨菪内酯含量进行检测，为规模化提取纯化东莨菪内酯提供可以借鉴的资料。
关键词：青蒿；东莨菪内酯；超声提取；高效液相色谱法
1东莨菪内酯的提取与测定
东莨菪内酯是一种香豆素类化合物，因为在有机溶剂中溶解度比较大，所以本试验利用有机溶剂提取法从青蒿中提取东莨菪内酯，以青蒿为原料，对超声时间、超声浓度、溶剂浓度及料液比四因素[1]，利用正交设计，获取最佳提取工艺条件，用HPLC法测定东莨菪内酯的含量[2]。
1.1样品中东莨菪内酯的提取
利用药品粉碎机将青蒿药材粉碎成粉末状，过80目筛后，存放于烧杯中。根据因素水平表1.1所对应的超声时间、超声温度、甲醇浓度及料液比，进行回流提取，再用中速定量滤纸过滤，滤液承接于25mL容量瓶中，重复冲洗滤渣后，将溶液定容至25mL，至于避光处存放。
1.1.1标准样品东莨菪内酯含量的测定
分别移取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0mL，0.062g/L的东莨菪内酯标准品溶液于25mL比色管中，利用甲醇（AR）溶液稀释至10mL刻度线，摇匀。因为东莨菪内酯在306nm处有一特征峰，因此在分光光度计上测定各溶液在306nm波长下的吸收值[3]。
1.1.2标准曲线的绘制
以所测吸光度值A306为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线并得到标准曲线方程。同样条件下测定样品溶液的吸光度A306，根据标准曲线方程计算东莨菪内酯的含量[4]。
1.1.3最佳提取条件的确定
以东莨菪内酯提取率作为考察指标，对数据作方差分析，获得最佳提取工艺方案（最佳超声时间、最佳超声温度、最佳甲醇浓度及最佳料液比）。
1.2 HPLC法测定青蒿提取液中东莨菪内酯的含量
①色谱条件
1）色谱柱：Hypersil-ODS2色谱柱（4.6mm*250mm，5um）
2）流动相：（1：4）甲醇（色谱纯）
3）检测波长：306nm
4）压力：8.0MPa
5）流速：0.9 ml/min
②待测样品的HPLC测定：
移取1mL东莨菪内酯标准品溶液至10mL容量瓶中，用甲醇（GR）溶液稀释至刻度线，然后分别精密吸取东莨菪内酯标准品溶液1，3，5，10，15，20μL进行HPLC测定，得到峰面积，根据待测样品的总体积计算出东莨菪内酯的总含量并根据待测物的原始质量计算东莨菪内酯百分比。
1.3提取结果分析
在本实验过程中对超声提取中影响青蒿中东莨菪内酯的提取率的超声温度、超声时间、甲醇浓度和料液比四个因素进行单因素试验。通过单因素试验发现，每个提取参量对青蒿中东莨菪内酯的提取率的影响并非是线性的。因此在单因素试验的基础上，以青蒿中东莨菪内酯的百分含量为试验的实验指标，利用L9（34）即4因素3水平进行正交试验设计分析方法，对青蒿中东莨菪内酯的超声提取工艺进行了优化研究。又通过极差分析，确定了各个因素对提取率影响大小的顺序为：料液比>超声温度>甲醇浓度>超声时间。结合影响的主要和次要因素，经过验证实验发现，当实验条件为超声温度50℃，超声时间30min，甲醇浓度60%，料液比1：48时，东莨菪内酯的提取率为最高。随后通过对标准品以及样品溶液进行精密度、线性关系、稳定性以及重复性试验[5]发现，不管是标准品或是样品溶液均可利用HPLC可靠并顺利的完成样品溶液浓度的测定。
2 总结与讨论
2.1总结
本实验通过以青蒿为原料，采用以超声时间、超声温度、料液比及甲醇浓度为四因素三水平的正交实验，其中四因素均为可优化东莨菪内酯的理化极限的条件，使得正交实验数据更为可靠，得到超声提取东莨菪内酯的最佳工艺条件：超声温度30℃，超声时间30min，甲醇浓度60%及料液比1：48。在高效液相色谱法检测过程中，通过对精密度、重复性、线性回归以及稳定性的数据发现该色谱条件下精密度、稳定性以及重复性均良好，且线性关系较好，得到青蒿中东莨菪内酯的含量高至0.0819mg/g。
2.2讨论
提取东莨菪内酯时，易志彪[6]、林永德[7]、张紫佳[8]等研究者多以提取方法、提取次数、提取溶剂、提取前水解时间、水解温度等因素考虑。对比本实验方案发现，甲醇是提取较好的提取溶剂；超声提取为操作最简单、可行性最强的提取方法；在以超声提取为前提下，料液比、超声时间、超声温度及甲醇濃度为最具影响的四因素。
HPLC法测定东莨菪内酯时，易志彪[6]、林永德[7]、刘伟[9]等使用的流动相大多为不同比例的水、冰醋酸及乙腈，但观察发现，（1：4）甲醇为流动相时，分离情况良好，出峰情况良好。
用紫外分光光度法测定东莨菪内酯，虽然方便快速，但精确度不够，只能作为参考，尤其是大批量从数据筛选的时候，用高效液相检测的分辨率和灵敏度高，重复性好，应该范围相对广[10]。在实验中，采用HPLC法，通过比较标准样品的图谱，可以很直观的鉴定出东莨菪内酯是否存在以及含量。
参考文献：
[1] 陈玉敏，曹红.高效液相色谱法测定雷公藤中东莨菪内酯的含量，中成药， 2005， 27（ 12）： 1461-14621
[2] 李娜.超声辅助提取苦菜单宁的工艺优化及其动力学研究[D].陕西师范大学：陕西师范大学， 2012年5月.
[3] 谭亮，张琦，范旭航，陈晓辉，钱忠直，毕开顺，贾英.高效液相色谱法同时测到的旱芹中东莨菪内酯和滨蒿内酯含量[J].中南药学， 2010年7月， 8（7）：583-587.
[4] 郑蕾.紫花地丁有效成分的提取及质量标准的研究[D].吉林大学， 2009年4月.
[5] 闫寒，李爱媛，赵一，李启云，李沧海等.青蒿总香豆素抗热应激作用及其机理的研究，中国实验方剂学杂志，2009，12（15）
[6] 易志彪，曾宝，赖小平.HPLC法测定枸杞中的东莨菪内酯含量[J].亚太传统医药， 2010年4月， 6（4）：13-15.
[7] 林永德，陈超凤，许振朝.HPLC法测定罗汉果止咳片中东莨菪内酯的含量[J].广西医药， 2009年11月， 31（11）：1698-1699.
[8] 张紫佳，张勉等. 丁公藤类药材及其混用品中总东莨菪内酯的含量测定[J]. 中国药学杂志， 2004， 39（12）：936-938.
[9] 孙玉刚，秦续文.高效液相色谱法同时测定青蒿绿原酸、隐绿原酸、东莨菪内酯含量，天津中医药，2012 ，29 （5）：484-486
[10] 张晓荣，彭光花，陈功锡，徐定华，常大成等.黄花蒿残渣挥发油化学成分及其抑菌活性分析，中草药，2011，42（12）.
作者简介：
第一作者，陈虹洁，（1989.4-）女，汉族，重庆市，本科，重庆科技学院，助教，食品安全与卫生，重庆轻工职业学院。
第二作者，梁巧，（1988.1）女，汉族，重庆市，本科，重庆大学，助教，食品安全与卫生，重庆轻工职业学院。
本文在超声提取青蒿中东莨菪内酯的过程中，建立了以超声时间、超声温度、溶剂浓度以及料液比四个单因素为基础，进行了4因素3水平的正交试验设计与综合分析，并利用高效液相色谱法对最佳工艺条件下提取青蒿中东莨菪内酯含量进行检测，为规模化提取纯化东莨菪内酯提供可以借鉴的资料。
关键词：青蒿；东莨菪内酯；超声提取；高效液相色谱法
1东莨菪内酯的提取与测定
东莨菪内酯是一种香豆素类化合物，因为在有机溶剂中溶解度比较大，所以本试验利用有机溶剂提取法从青蒿中提取东莨菪内酯，以青蒿为原料，对超声时间、超声浓度、溶剂浓度及料液比四因素[1]，利用正交设计，获取最佳提取工艺条件，用HPLC法测定东莨菪内酯的含量[2]。
1.1样品中东莨菪内酯的提取
利用药品粉碎机将青蒿药材粉碎成粉末状，过80目筛后，存放于烧杯中。根据因素水平表1.1所对应的超声时间、超声温度、甲醇浓度及料液比，进行回流提取，再用中速定量滤纸过滤，滤液承接于25mL容量瓶中，重复冲洗滤渣后，将溶液定容至25mL，至于避光处存放。
1.1.1标准样品东莨菪内酯含量的测定
分别移取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0mL，0.062g/L的东莨菪内酯标准品溶液于25mL比色管中，利用甲醇（AR）溶液稀释至10mL刻度线，摇匀。因为东莨菪内酯在306nm处有一特征峰，因此在分光光度计上测定各溶液在306nm波长下的吸收值[3]。
1.1.2标准曲线的绘制
以所测吸光度值A306为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线并得到标准曲线方程。同样条件下测定样品溶液的吸光度A306，根据标准曲线方程计算东莨菪内酯的含量[4]。
1.1.3最佳提取条件的确定
以东莨菪内酯提取率作为考察指标，对数据作方差分析，获得最佳提取工艺方案（最佳超声时间、最佳超声温度、最佳甲醇浓度及最佳料液比）。
1.2 HPLC法测定青蒿提取液中东莨菪内酯的含量
①色谱条件
1）色谱柱：Hypersil-ODS2色谱柱（4.6mm*250mm，5um）
2）流动相：（1：4）甲醇（色谱纯）
3）检测波长：306nm
4）压力：8.0MPa
5）流速：0.9 ml/min
②待测样品的HPLC测定：
移取1mL东莨菪内酯标准品溶液至10mL容量瓶中，用甲醇（GR）溶液稀释至刻度线，然后分别精密吸取东莨菪内酯标准品溶液1，3，5，10，15，20μL进行HPLC测定，得到峰面积，根据待测样品的总体积计算出东莨菪内酯的总含量并根据待测物的原始质量计算东莨菪内酯百分比。
1.3提取结果分析
在本实验过程中对超声提取中影响青蒿中东莨菪内酯的提取率的超声温度、超声时间、甲醇浓度和料液比四个因素进行单因素试验。通过单因素试验发现，每个提取参量对青蒿中东莨菪内酯的提取率的影响并非是线性的。因此在单因素试验的基础上，以青蒿中东莨菪内酯的百分含量为试验的实验指标，利用L9（34）即4因素3水平进行正交试验设计分析方法，对青蒿中东莨菪内酯的超声提取工艺进行了优化研究。又通过极差分析，确定了各个因素对提取率影响大小的顺序为：料液比>超声温度>甲醇浓度>超声时间。结合影响的主要和次要因素，经过验证实验发现，当实验条件为超声温度50℃，超声时间30min，甲醇浓度60%，料液比1：48时，东莨菪内酯的提取率为最高。随后通过对标准品以及样品溶液进行精密度、线性关系、稳定性以及重复性试验[5]发现，不管是标准品或是样品溶液均可利用HPLC可靠并顺利的完成样品溶液浓度的测定。
2 总结与讨论
2.1总结
本实验通过以青蒿为原料，采用以超声时间、超声温度、料液比及甲醇浓度为四因素三水平的正交实验，其中四因素均为可优化东莨菪内酯的理化极限的条件，使得正交实验数据更为可靠，得到超声提取东莨菪内酯的最佳工艺条件：超声温度30℃，超声时间30min，甲醇浓度60%及料液比1：48。在高效液相色谱法检测过程中，通过对精密度、重复性、线性回归以及稳定性的数据发现该色谱条件下精密度、稳定性以及重复性均良好，且线性关系较好，得到青蒿中东莨菪内酯的含量高至0.0819mg/g。
2.2讨论
提取东莨菪内酯时，易志彪[6]、林永德[7]、张紫佳[8]等研究者多以提取方法、提取次数、提取溶剂、提取前水解时间、水解温度等因素考虑。对比本实验方案发现，甲醇是提取较好的提取溶剂；超声提取为操作最简单、可行性最强的提取方法；在以超声提取为前提下，料液比、超声时间、超声温度及甲醇濃度为最具影响的四因素。
HPLC法测定东莨菪内酯时，易志彪[6]、林永德[7]、刘伟[9]等使用的流动相大多为不同比例的水、冰醋酸及乙腈，但观察发现，（1：4）甲醇为流动相时，分离情况良好，出峰情况良好。
用紫外分光光度法测定东莨菪内酯，虽然方便快速，但精确度不够，只能作为参考，尤其是大批量从数据筛选的时候，用高效液相检测的分辨率和灵敏度高，重复性好，应该范围相对广[10]。在实验中，采用HPLC法，通过比较标准样品的图谱，可以很直观的鉴定出东莨菪内酯是否存在以及含量。
参考文献：
[1] 陈玉敏，曹红.高效液相色谱法测定雷公藤中东莨菪内酯的含量，中成药， 2005， 27（ 12）： 1461-14621
[2] 李娜.超声辅助提取苦菜单宁的工艺优化及其动力学研究[D].陕西师范大学：陕西师范大学， 2012年5月.
[3] 谭亮，张琦，范旭航，陈晓辉，钱忠直，毕开顺，贾英.高效液相色谱法同时测到的旱芹中东莨菪内酯和滨蒿内酯含量[J].中南药学， 2010年7月， 8（7）：583-587.
[4] 郑蕾.紫花地丁有效成分的提取及质量标准的研究[D].吉林大学， 2009年4月.
[5] 闫寒，李爱媛，赵一，李启云，李沧海等.青蒿总香豆素抗热应激作用及其机理的研究，中国实验方剂学杂志，2009，12（15）
[6] 易志彪，曾宝，赖小平.HPLC法测定枸杞中的东莨菪内酯含量[J].亚太传统医药， 2010年4月， 6（4）：13-15.
[7] 林永德，陈超凤，许振朝.HPLC法测定罗汉果止咳片中东莨菪内酯的含量[J].广西医药， 2009年11月， 31（11）：1698-1699.
[8] 张紫佳，张勉等. 丁公藤类药材及其混用品中总东莨菪内酯的含量测定[J]. 中国药学杂志， 2004， 39（12）：936-938.
[9] 孙玉刚，秦续文.高效液相色谱法同时测定青蒿绿原酸、隐绿原酸、东莨菪内酯含量，天津中医药，2012 ，29 （5）：484-486
[10] 张晓荣，彭光花，陈功锡，徐定华，常大成等.黄花蒿残渣挥发油化学成分及其抑菌活性分析，中草药，2011，42（12）.
作者简介：
第一作者，陈虹洁，（1989.4-）女，汉族，重庆市，本科，重庆科技学院，助教，食品安全与卫生，重庆轻工职业学院。
第二作者，梁巧，（1988.1）女，汉族，重庆市，本科，重庆大学，助教，食品安全与卫生，重庆轻工职业学院。