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摘要 目的： 探讨异氟醚预处理对大鼠脊髓缺血再灌注损伤时5脂氧合酶表达的影响。方法： 雄性成年SD大鼠45只，体重250～300g，采用随机数字表法，将大鼠随机分为3组（n=15）：假手术组（S组）、脊髓缺血再灌注组（1/R组）和异氟醚预处理组（I组）。采用胸主动脉球囊阻断+体循环低血压法制备大鼠脊髓缺血再灌注模型。I组吸入2%异氟醚2h，24h后制备模型。于再灌注24h时采用神经功能缺陷评分（NDS评分）法评价大鼠神经功能，随后处死取脊髓，分别采用Western blot法和RT-PCR法测定5-LOX、NF-kB、髓样分化因子88（MyD88）蛋白及其mRNA的表达水平。应用ELISA检测血清中TNF-a的含量。结果： 与S组比较，1/R组和l组神经功能缺陷评分升高，1/R组5-LOX和MyD88蛋白及其mRNA表达上调，TNF-a含量升高，I组5-LOX mRNA和MyD88蛋白及其mRNA表达上调（P<0.05）;与1/R组比较，I组神经功能缺陷评分降低，5-LOX和MyD88蛋白及其mRNA表达下调，TNF-a含量下降（P<0.05）。结论： 异氟醚预处理可能通过下调5-LOX表达，抑制MyD88信号通路，从而减轻大鼠脊髓缺血再灌注损伤。
关键词：生四烯酸盐5-脂氧合酶;异氟醚;缺血预处理;再灌注损伤;脊髓
脊髓缺血再灌注损伤在严重创伤或术中发生出血性休克患者的临床病理生理过程中发挥关键性的作用，因此此类手术的麻醉药选择除了能达到满意的麻醉疗效外，还应具有脊髓保护作用[1]。异氟醚作为吸入性临床常用的麻醉药，在动物和细胞实验研究均表明，异氟醚预处理可减轻脊髓缺血再灌注损伤。5-脂氧合酶（5-LOX）是脂类信号分子生物合成过程中的关键酶，参与了脊髓缺血再灌注损伤的病理生理过程。异氟醚预处理减轻脊髓缺血再灌注损伤的机制是否与5-LOX有关尚有待研究。本研究拟探讨异氟醚预处理对大鼠脊髓缺血再灌注时5-LOX表达的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物 SPF级C57BL/6小鼠， 雄性，体质量 20～26g，由南华大学实验动物部提供。
1.2 主要试剂和仪器 RNA反转录试剂盒和SYBR试剂 （瑞士 罗氏公司）;3.4%异氟醚（雅培制药有限公司）;实时荧光定量PCR仪（瑞士 罗氏公司）; 蛋白提取试剂盒（广州市锐博生物科技有限公司）;MyD88，NF-kB以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（Santa Cruz， USA）;ELISA 试剂盒购自广州市锐博生物科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 动物分组 成年雄性SD大鼠45只，体重250～300g，由南华大学实验动物中心提供，采用随机数字表法，将大鼠随机分为3组（n=15）：假手术组（S组）、脊髓缺血再灌注组（I/R组）和异氟醚预处理组（I组）。三组均为普通饲料饲养，自由饮水。
1.3.2 小鼠脊髓缺血再灌注损伤模型的建立 详细内容见本前期课题组的报道。动物制模成功后按实验分组进行相应操作。
1.3.3 NDS评分 于再灌注24 h时采用神经功能缺陷评分（NDS评分）法评价大鼠神经缺陷功能，具体内容见前期本课题的报道。
1.3.4 5-LOX、MyD88及NF-kB的mRNA表达水平的检测
复制成功脊髓再灌注损伤的模型后24h测定神经功能，每组随机抽取6只大鼠并处死大鼠取脊髓组织，置入液态氮中冻存备用。将其组织于RNA iso plus中研磨，氯仿抽提、75%乙醇沉淀组织内RNA，定量后反转录成cDNA。加入针对不同目标基因片段的引物，暗室内上样后进行实时荧光定量PCR，分析曲线并作统计分析。以目标基因吸光度值与β-actin吸光度值的比值反映5-LOX、MyD88的mRNA表达。
1.3.5 Western blot法测定5-LOX、MyD88及NF-kB蛋白的表达
复制成功脊髓再灌注损伤的模型后24h测定神经功能，每组随机抽取6只大鼠并处死大鼠取其组织，依照说明书提取蛋白并测定其浓度。加预冷蛋白提取液稀释于-70℃冰箱保存。相应浓度和等量的样品蛋白经SDS-PAGE电泳后转膜，按次序加入相应的一抗及二抗进行免疫性反应，DAB染色反应，膜晾干后拍照，蛋白条带密度的定量分析运用凝胶图像Image J软件分析目标蛋白条带灰度值，以其与内参GAPDH灰度值的比值反映各物质的表达水平。
1.3.6 肿瘤坏死因子（TNF-a）的检测 应用ELISA检测三组血清中TNF-a的含量，操作步骤严格按试剂盒说明书进行。
1.4 统计学方法 采用SPSS19.0软件包，数据用均数±标准差表示，计量资料两组采用t检验，多组数据比较采用F检验及单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
与S组比较，I/R组5-LOX和MyD88蛋白及其mRNA表达上调，且NDS评分及血清TNF-a水平升高，I组5-LOXmRNA和MyD88蛋白及其mRNA表达上调（P<0.05）;与I/R组比较，I组5-LOX和MyD88蛋白及其mRNA表达下调，且NDS评分及血清TNF-a水平降低（P<0.05），见表1及图1。
表1 三组脊髓组织5-LOX、MyD88、NF-kB、TNF-a的表达及NDS评分的比较（X±s）
注：与S组比较，aP<0.05;与I/R组比较，bP<0.05
3 讨 论
研究证实，缺血再灌注损伤后24小时Beclin 1及LC3蛋白等自噬基因水平高故本研究以此为研究时点[2]。结果表明，大鼠脊髓缺血再灌注时神经功能缺陷评分升高，表明大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型制备成功。本研究依照文献的方法[3]进行异氟醚预处理，结果表明异氟醚预处理可降低缺血再灌注期间神经功能缺陷评分，表明异氟醚预处理减轻了大鼠脊髓缺血再灌注损伤。
本研究结果显示，大鼠脊髓缺血再灌注期间5-LOX和MyD88蛋白及其mRNA表达明显上调，异氟醚预处理后其表达明显下调，表明异氟醚预处理可通过下调5-LOX表达，抑制MyD88/NF-kB信号通路，从而减轻大鼠脊髓缺血再灌注损伤。
脊髓缺血再灌注时，5-LOX激活蛋白首先活化，进而引起5-LOX表达上调。5-LOX表达上调可诱导MyD88表达和激活TNF-a，从而激活MyD88/NF-kB信号通路，释放促炎细胞因子，导致炎性级联反应，从而诱发脊髓损伤[4]。异氟醚下调5-LOX表达的具体机制尚待进一步研究。
综上所述，异氟醚预处理可能通过下调5-LOX表达，抑制MyD88/NF-kB信号通路，从而减轻大鼠脊髓缺血再灌注损伤。
参考文献：
[1]艾琪勇，罗越，刘辉等. 脊髓缺血再灌注损伤的发病机制与治疗进展[J]实用医学杂志，2014，30（16）：2678-2680.
[2]曹宁，魏兴，陈培敏等.异氟醚预处理对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的影响及自噬在其中的作用[J]中华麻醉学杂志，2013，33（3）：612-615.
[3]孙莹，张静，徐青荣等. 一氧化氮在异氟醚后处理减轻大鼠离体心脏缺血再灌注时自噬和细胞凋亡中的作用[J]中华麻醉学杂志，2014，34（9）：1123-1127.
[4]Liang K， Ye Y， Wang Y， et al. Formononetin mediates neuroprotection against cerebral ischemia/reperfusion in rats via downregulation of the Bax/Bcl-2 ratio and upregulation PI3K/Akt signaling pathway[J]J Neurol Sci 2014，22（15）：100-114.
关键词：生四烯酸盐5-脂氧合酶;异氟醚;缺血预处理;再灌注损伤;脊髓
脊髓缺血再灌注损伤在严重创伤或术中发生出血性休克患者的临床病理生理过程中发挥关键性的作用，因此此类手术的麻醉药选择除了能达到满意的麻醉疗效外，还应具有脊髓保护作用[1]。异氟醚作为吸入性临床常用的麻醉药，在动物和细胞实验研究均表明，异氟醚预处理可减轻脊髓缺血再灌注损伤。5-脂氧合酶（5-LOX）是脂类信号分子生物合成过程中的关键酶，参与了脊髓缺血再灌注损伤的病理生理过程。异氟醚预处理减轻脊髓缺血再灌注损伤的机制是否与5-LOX有关尚有待研究。本研究拟探讨异氟醚预处理对大鼠脊髓缺血再灌注时5-LOX表达的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物 SPF级C57BL/6小鼠， 雄性，体质量 20～26g，由南华大学实验动物部提供。
1.2 主要试剂和仪器 RNA反转录试剂盒和SYBR试剂 （瑞士 罗氏公司）;3.4%异氟醚（雅培制药有限公司）;实时荧光定量PCR仪（瑞士 罗氏公司）; 蛋白提取试剂盒（广州市锐博生物科技有限公司）;MyD88，NF-kB以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（Santa Cruz， USA）;ELISA 试剂盒购自广州市锐博生物科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 动物分组 成年雄性SD大鼠45只，体重250～300g，由南华大学实验动物中心提供，采用随机数字表法，将大鼠随机分为3组（n=15）：假手术组（S组）、脊髓缺血再灌注组（I/R组）和异氟醚预处理组（I组）。三组均为普通饲料饲养，自由饮水。
1.3.2 小鼠脊髓缺血再灌注损伤模型的建立 详细内容见本前期课题组的报道。动物制模成功后按实验分组进行相应操作。
1.3.3 NDS评分 于再灌注24 h时采用神经功能缺陷评分（NDS评分）法评价大鼠神经缺陷功能，具体内容见前期本课题的报道。
1.3.4 5-LOX、MyD88及NF-kB的mRNA表达水平的检测
复制成功脊髓再灌注损伤的模型后24h测定神经功能，每组随机抽取6只大鼠并处死大鼠取脊髓组织，置入液态氮中冻存备用。将其组织于RNA iso plus中研磨，氯仿抽提、75%乙醇沉淀组织内RNA，定量后反转录成cDNA。加入针对不同目标基因片段的引物，暗室内上样后进行实时荧光定量PCR，分析曲线并作统计分析。以目标基因吸光度值与β-actin吸光度值的比值反映5-LOX、MyD88的mRNA表达。
1.3.5 Western blot法测定5-LOX、MyD88及NF-kB蛋白的表达
复制成功脊髓再灌注损伤的模型后24h测定神经功能，每组随机抽取6只大鼠并处死大鼠取其组织，依照说明书提取蛋白并测定其浓度。加预冷蛋白提取液稀释于-70℃冰箱保存。相应浓度和等量的样品蛋白经SDS-PAGE电泳后转膜，按次序加入相应的一抗及二抗进行免疫性反应，DAB染色反应，膜晾干后拍照，蛋白条带密度的定量分析运用凝胶图像Image J软件分析目标蛋白条带灰度值，以其与内参GAPDH灰度值的比值反映各物质的表达水平。
1.3.6 肿瘤坏死因子（TNF-a）的检测 应用ELISA检测三组血清中TNF-a的含量，操作步骤严格按试剂盒说明书进行。
1.4 统计学方法 采用SPSS19.0软件包，数据用均数±标准差表示，计量资料两组采用t检验，多组数据比较采用F检验及单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
与S组比较，I/R组5-LOX和MyD88蛋白及其mRNA表达上调，且NDS评分及血清TNF-a水平升高，I组5-LOXmRNA和MyD88蛋白及其mRNA表达上调（P<0.05）;与I/R组比较，I组5-LOX和MyD88蛋白及其mRNA表达下调，且NDS评分及血清TNF-a水平降低（P<0.05），见表1及图1。
表1 三组脊髓组织5-LOX、MyD88、NF-kB、TNF-a的表达及NDS评分的比较（X±s）
注：与S组比较，aP<0.05;与I/R组比较，bP<0.05
3 讨 论
研究证实，缺血再灌注损伤后24小时Beclin 1及LC3蛋白等自噬基因水平高故本研究以此为研究时点[2]。结果表明，大鼠脊髓缺血再灌注时神经功能缺陷评分升高，表明大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型制备成功。本研究依照文献的方法[3]进行异氟醚预处理，结果表明异氟醚预处理可降低缺血再灌注期间神经功能缺陷评分，表明异氟醚预处理减轻了大鼠脊髓缺血再灌注损伤。
本研究结果显示，大鼠脊髓缺血再灌注期间5-LOX和MyD88蛋白及其mRNA表达明显上调，异氟醚预处理后其表达明显下调，表明异氟醚预处理可通过下调5-LOX表达，抑制MyD88/NF-kB信号通路，从而减轻大鼠脊髓缺血再灌注损伤。
脊髓缺血再灌注时，5-LOX激活蛋白首先活化，进而引起5-LOX表达上调。5-LOX表达上调可诱导MyD88表达和激活TNF-a，从而激活MyD88/NF-kB信号通路，释放促炎细胞因子，导致炎性级联反应，从而诱发脊髓损伤[4]。异氟醚下调5-LOX表达的具体机制尚待进一步研究。
综上所述，异氟醚预处理可能通过下调5-LOX表达，抑制MyD88/NF-kB信号通路，从而减轻大鼠脊髓缺血再灌注损伤。
参考文献：
[1]艾琪勇，罗越，刘辉等. 脊髓缺血再灌注损伤的发病机制与治疗进展[J]实用医学杂志，2014，30（16）：2678-2680.
[2]曹宁，魏兴，陈培敏等.异氟醚预处理对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的影响及自噬在其中的作用[J]中华麻醉学杂志，2013，33（3）：612-615.
[3]孙莹，张静，徐青荣等. 一氧化氮在异氟醚后处理减轻大鼠离体心脏缺血再灌注时自噬和细胞凋亡中的作用[J]中华麻醉学杂志，2014，34（9）：1123-1127.
[4]Liang K， Ye Y， Wang Y， et al. Formononetin mediates neuroprotection against cerebral ischemia/reperfusion in rats via downregulation of the Bax/Bcl-2 ratio and upregulation PI3K/Akt signaling pathway[J]J Neurol Sci 2014，22（15）：100-114.