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【摘 要】目的：细胞增殖抗原标记物（Ki67）为细胞增殖的一个重要生物学指标。本研究旨在探讨中老年患者乳腺癌组织中Ki67的表达水平及其与临床病理因素的相关性。方法：利用免疫组化方法检测118例中老年患者（年龄>35岁）乳腺癌组织中Ki67的表达，并结合临床病理因素进行相关性分析。结果：Ki67在中老年乳腺癌组织中阳性表达率为75.4%（89/118），其阳性表达与病理分期及腋淋巴结转移状况显著相关（P<0.05），与年龄、癌灶大小无显著相关（P>0.05）。结论：Ki67是目前评估肿瘤细胞增殖活性的可靠的指标，其高表达可作为判断乳腺癌发生、发展及不良预后的生物学指标。
【关键词】乳腺癌；细胞增殖抗原；Ki67
【中图分类号】R737.9 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）11—0053—01
ki67抗原是细胞增殖相关蛋白，与细胞的有丝分裂有关，其表达能反映肿瘤的增殖活性。是近年来认为更能有效评估肿瘤细胞增殖活性的重要标记物[1]。本研究用免疫组化法检测中老年患者乳腺癌组织中Ki67的表达，结合临床病理因素，分析它的相关性及其临床意义。旨在探讨ki67是否可以作为判断中老年患者乳腺癌的恶性程度及预后的指标。
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集无锡市第二人民医院普外科2010年1月～2013年6月保存的乳腺癌术后组织标本118例，均經病理检查确诊。患者年龄37～82岁，中位年龄51岁。患者术前均未接受过放疗、化疗及内分泌治疗等抗癌治疗。全部病例常规行乳腺钼靶照片、胸片、腹部B超、血常规及生化肝肾功能检查，必要时做全身ECT，以排除远处转移。按照国际抗癌联盟（UICC）2002年版TNM分期标准：I期25例，Ⅱ期74例，Ⅲ期19例。按照WHO乳腺肿瘤组织学类型分类标准：浸润性导管癌113例，浸润性小叶癌2例，粘液腺癌3例。
1.2免疫组织化学染色 Ki67抗体（RMA-0542）及工作液均购自福州迈新生物技术开发有限公司。组织标本以10%甲醛液固定24 h，常规石蜡包埋，制备5μm厚连续切片，贴附于涂有APES处理的载玻片上，60℃烤片2小时。免疫组织化学染色：①石蜡切片脱蜡、水化，自来水冲洗；②室温孵育10 min，PBS冲洗3次，每次3 min（3×3min）；③滴加第一抗体，室温下孵育或4℃过夜，PBS 冲洗3×3min④滴加反应增强液，室温孵育20 min，PBS 冲洗3×3min；⑤滴加酶标抗兔IgG聚合物，室温下孵育30 min，PBS冲洗，3×3min；⑥滴加新鲜配置的DAB显色试剂显色⑦自来水充分冲洗、复染、封片。
1.3判断标准 Ki67阳性细胞多数为核着色，呈棕黄色，少数为较弱的细胞质染色。每张切片随机取3个高倍视野，以阳性细胞比例的平均值定义为该肿瘤的阳性细胞百分比。阳性细胞数<10%为阴性；阳性细胞数在10%一25%为弱阳性（+）；阳性细胞数在26—50%为阳性（++）；阳性细胞数>50%为强阳性（+++）。
1.4统计学方法 采用SPSS 12.0 for windows统计软件包进行统计分析，计数资料采用 检验，相关性分析采用Spearman相关分析。P 2 结果
2.1 Ki67在中老年患者乳腺癌组织中的表达 在所有118例中老年患者乳腺癌组织中，有89例Ki67染色呈阳性，其阳性率为75.4%。其中“+”为66例（占55.9%），“++”为15例（占12.7%），“+++”为8例（占6.7%）。
2.2 Ki67表达与乳腺癌临床病理因素之间的关系 在不同的年龄和肿瘤大小的乳腺癌组织中，Ki67的表达差异无统计学意义（P>0.05）；而淋巴结转移情况及分期不同的乳腺癌组织中，Ki67的表达差异有统计学意义（P<0.05），即分期越晚或伴有淋巴结转移时，Ki67阳性率越高。（见表1）
3 讨论
随着我国人口的老龄化，加上我国对疾病预防、诊断和治疗的进步，我国的人均预期寿命不断延长，使得我国中老年女性乳腺癌的发病率大大增加。我国的女性乳腺癌发病率明显低于西方国家，且发病年龄比西方国家的女性平均提前10年～15年，我国乳腺癌的发病的高峰年龄段为45～55岁，因此在我国乳腺癌患者中中老年妇女占多数。随着年龄的增长，中老年乳腺癌患者的生理状态慢慢在发生退化，其具有特殊的病理生理特点，与年轻患者相比，一般其临床表现为病程相对较长、发展相对较慢、而且其侵袭性相对较低等特点[2]。
众所周知，肿瘤的发生、发展与细胞的增殖分化异常以及细胞凋亡的下降密切相关。而Ki67最早在1983年由德国学者Gerdes等在霍奇金淋巴瘤源性细胞系中，使用鼠单克隆抗体抗核抗原的研究中发现，它的功能和细胞有丝分裂有关，是目前较为肯定的核增殖标记物。它在GO期无表达，Gl中期到晚期出现，S期和G2期逐渐增加，至M期到达高峰。由于其半衰期短，Ki67抗原在细胞分裂晚期很快消失，脱离细胞周期后迅速降解，被认为能够比较理想的反映细胞增殖活性，是目前评估肿瘤细胞增殖活性、判断肿瘤侵袭力和肿瘤预后的最可靠的指标[3]。近年来很多研究者通过检测肿瘤细胞Ki67的表达来评估患者的预后，认为Ki67表达水平的高低反映了细胞增殖状态，对评价肿瘤的生物学行为、判断其危害性具有重要意义。很多研究表明在多种恶性实体肿瘤中Ki67的表达率远高于正常组织，其表达能可靠而迅速地反应恶性肿瘤增殖率，与多种恶性肿瘤的发展、转移、预后相关。
目前，关于Ki67是否能作为乳腺癌的预测以及用来判断乳腺癌预后的指标成为大家研究的焦点。Klintman等[4]研究表明Ki67是雌激素受体阳性及组织病理分级2级的淋巴结阴性乳腺癌患者的预后因素，并提出Ki67可以成为病理分级的补充指标。在本研究中，Ki67在中老年患者乳腺癌组织中的阳性率为75.4%，略低于国外报道的乳腺癌组织中Ki67的阳性率78.0%，上述结果一定程度上表明中老年乳腺癌的增殖活性有所降低。另外，本研究还显示随着转移淋巴结的数目增多以及肿瘤TNM分期病期的加重，Ki67的阳性表达率显著升高（P<0.05），这进一步提示Ki67的表达与乳腺癌的生长、浸润以及腋淋巴结转移之间密切相关。通过这一结果，我们可以得出Ki67表达阳性且其表达度越高乳腺癌细胞增殖越活跃，该肿瘤的生长速度越快，恶性程度更高，侵袭性更强，同时转移的机会也越高，预后也相对越差。 有研究表明，ki67抗原表達可反映肿瘤的细胞增殖活性，与恶性肿瘤的发展、转移和预后高度相关[5]。而通过本研究结果同样也显示，ki67阳性表达率与中老年乳腺癌肿瘤大小、患者年龄不相关；而与淋巴结转移及肿瘤分期相关（P<0.05），这进一步说明ki67阳性表达者的癌细胞增殖程度明显升高，具有更强的侵袭能力，更易于发生淋巴结转移甚至远处全身转移，其预后也越差。因此，作为一个能够准确反映肿瘤细胞增殖活性的生物学指标，临床上可以根据Ki67表达水平，结合患者的临床病理特征，评估肿瘤的侵袭性与患者预后，同时未来或许也可以根据Ki67表达阳性这个新靶点作为目标，研制出新一代的靶向治疗药，制定更有针对性的个体化治疗，进而提高中老年乳腺癌患者的生存率及生活质量。
参考文献：
[1]Tan PH，Bay BH，Yip G，et a1.Immunohistochemical detection of ki67 in breast cancer correlates with transcriptional regulation of genes related to apoptosis and cell death[J].Mod Pathol 2005，18（3）：374-381.
[2] 张斌.老年人乳腺癌[J].中国癌症杂志，2005，15（5）：422-425.
[3] Papantoniou VJ， Souvatsoglou MA，Valotassiou VJ，et a1.Relationship of cell nrolifemfion （Ki67） to 99mTc2（V）DMSA up take in breast cancer[J].Breast Cancer Res，2004；6（2）：56—62.
[4]Klintman M，Benddll PO，Grabau D，et al.The prognostic Value 0f Ki67 is dependenton estrogen receptor status and histological grade in premenopausal patients with node-negative breast cancer[J].Mod Pathol，2010；23（2）：251-259.
[5] Retsky M，Baum M，Demicheli R et a1.Prognostic value of ki67 expression after short-term presurgjcal endocrine therapy for primary breast cancer[J].J Natl Cancer inst 2007，99（13）：1053—1054.
【关键词】乳腺癌；细胞增殖抗原；Ki67
【中图分类号】R737.9 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）11—0053—01
ki67抗原是细胞增殖相关蛋白，与细胞的有丝分裂有关，其表达能反映肿瘤的增殖活性。是近年来认为更能有效评估肿瘤细胞增殖活性的重要标记物[1]。本研究用免疫组化法检测中老年患者乳腺癌组织中Ki67的表达，结合临床病理因素，分析它的相关性及其临床意义。旨在探讨ki67是否可以作为判断中老年患者乳腺癌的恶性程度及预后的指标。
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集无锡市第二人民医院普外科2010年1月～2013年6月保存的乳腺癌术后组织标本118例，均經病理检查确诊。患者年龄37～82岁，中位年龄51岁。患者术前均未接受过放疗、化疗及内分泌治疗等抗癌治疗。全部病例常规行乳腺钼靶照片、胸片、腹部B超、血常规及生化肝肾功能检查，必要时做全身ECT，以排除远处转移。按照国际抗癌联盟（UICC）2002年版TNM分期标准：I期25例，Ⅱ期74例，Ⅲ期19例。按照WHO乳腺肿瘤组织学类型分类标准：浸润性导管癌113例，浸润性小叶癌2例，粘液腺癌3例。
1.2免疫组织化学染色 Ki67抗体（RMA-0542）及工作液均购自福州迈新生物技术开发有限公司。组织标本以10%甲醛液固定24 h，常规石蜡包埋，制备5μm厚连续切片，贴附于涂有APES处理的载玻片上，60℃烤片2小时。免疫组织化学染色：①石蜡切片脱蜡、水化，自来水冲洗；②室温孵育10 min，PBS冲洗3次，每次3 min（3×3min）；③滴加第一抗体，室温下孵育或4℃过夜，PBS 冲洗3×3min④滴加反应增强液，室温孵育20 min，PBS 冲洗3×3min；⑤滴加酶标抗兔IgG聚合物，室温下孵育30 min，PBS冲洗，3×3min；⑥滴加新鲜配置的DAB显色试剂显色⑦自来水充分冲洗、复染、封片。
1.3判断标准 Ki67阳性细胞多数为核着色，呈棕黄色，少数为较弱的细胞质染色。每张切片随机取3个高倍视野，以阳性细胞比例的平均值定义为该肿瘤的阳性细胞百分比。阳性细胞数<10%为阴性；阳性细胞数在10%一25%为弱阳性（+）；阳性细胞数在26—50%为阳性（++）；阳性细胞数>50%为强阳性（+++）。
1.4统计学方法 采用SPSS 12.0 for windows统计软件包进行统计分析，计数资料采用 检验，相关性分析采用Spearman相关分析。P
2.1 Ki67在中老年患者乳腺癌组织中的表达 在所有118例中老年患者乳腺癌组织中，有89例Ki67染色呈阳性，其阳性率为75.4%。其中“+”为66例（占55.9%），“++”为15例（占12.7%），“+++”为8例（占6.7%）。
2.2 Ki67表达与乳腺癌临床病理因素之间的关系 在不同的年龄和肿瘤大小的乳腺癌组织中，Ki67的表达差异无统计学意义（P>0.05）；而淋巴结转移情况及分期不同的乳腺癌组织中，Ki67的表达差异有统计学意义（P<0.05），即分期越晚或伴有淋巴结转移时，Ki67阳性率越高。（见表1）
3 讨论
随着我国人口的老龄化，加上我国对疾病预防、诊断和治疗的进步，我国的人均预期寿命不断延长，使得我国中老年女性乳腺癌的发病率大大增加。我国的女性乳腺癌发病率明显低于西方国家，且发病年龄比西方国家的女性平均提前10年～15年，我国乳腺癌的发病的高峰年龄段为45～55岁，因此在我国乳腺癌患者中中老年妇女占多数。随着年龄的增长，中老年乳腺癌患者的生理状态慢慢在发生退化，其具有特殊的病理生理特点，与年轻患者相比，一般其临床表现为病程相对较长、发展相对较慢、而且其侵袭性相对较低等特点[2]。
众所周知，肿瘤的发生、发展与细胞的增殖分化异常以及细胞凋亡的下降密切相关。而Ki67最早在1983年由德国学者Gerdes等在霍奇金淋巴瘤源性细胞系中，使用鼠单克隆抗体抗核抗原的研究中发现，它的功能和细胞有丝分裂有关，是目前较为肯定的核增殖标记物。它在GO期无表达，Gl中期到晚期出现，S期和G2期逐渐增加，至M期到达高峰。由于其半衰期短，Ki67抗原在细胞分裂晚期很快消失，脱离细胞周期后迅速降解，被认为能够比较理想的反映细胞增殖活性，是目前评估肿瘤细胞增殖活性、判断肿瘤侵袭力和肿瘤预后的最可靠的指标[3]。近年来很多研究者通过检测肿瘤细胞Ki67的表达来评估患者的预后，认为Ki67表达水平的高低反映了细胞增殖状态，对评价肿瘤的生物学行为、判断其危害性具有重要意义。很多研究表明在多种恶性实体肿瘤中Ki67的表达率远高于正常组织，其表达能可靠而迅速地反应恶性肿瘤增殖率，与多种恶性肿瘤的发展、转移、预后相关。
目前，关于Ki67是否能作为乳腺癌的预测以及用来判断乳腺癌预后的指标成为大家研究的焦点。Klintman等[4]研究表明Ki67是雌激素受体阳性及组织病理分级2级的淋巴结阴性乳腺癌患者的预后因素，并提出Ki67可以成为病理分级的补充指标。在本研究中，Ki67在中老年患者乳腺癌组织中的阳性率为75.4%，略低于国外报道的乳腺癌组织中Ki67的阳性率78.0%，上述结果一定程度上表明中老年乳腺癌的增殖活性有所降低。另外，本研究还显示随着转移淋巴结的数目增多以及肿瘤TNM分期病期的加重，Ki67的阳性表达率显著升高（P<0.05），这进一步提示Ki67的表达与乳腺癌的生长、浸润以及腋淋巴结转移之间密切相关。通过这一结果，我们可以得出Ki67表达阳性且其表达度越高乳腺癌细胞增殖越活跃，该肿瘤的生长速度越快，恶性程度更高，侵袭性更强，同时转移的机会也越高，预后也相对越差。 有研究表明，ki67抗原表達可反映肿瘤的细胞增殖活性，与恶性肿瘤的发展、转移和预后高度相关[5]。而通过本研究结果同样也显示，ki67阳性表达率与中老年乳腺癌肿瘤大小、患者年龄不相关；而与淋巴结转移及肿瘤分期相关（P<0.05），这进一步说明ki67阳性表达者的癌细胞增殖程度明显升高，具有更强的侵袭能力，更易于发生淋巴结转移甚至远处全身转移，其预后也越差。因此，作为一个能够准确反映肿瘤细胞增殖活性的生物学指标，临床上可以根据Ki67表达水平，结合患者的临床病理特征，评估肿瘤的侵袭性与患者预后，同时未来或许也可以根据Ki67表达阳性这个新靶点作为目标，研制出新一代的靶向治疗药，制定更有针对性的个体化治疗，进而提高中老年乳腺癌患者的生存率及生活质量。
参考文献：
[1]Tan PH，Bay BH，Yip G，et a1.Immunohistochemical detection of ki67 in breast cancer correlates with transcriptional regulation of genes related to apoptosis and cell death[J].Mod Pathol 2005，18（3）：374-381.
[2] 张斌.老年人乳腺癌[J].中国癌症杂志，2005，15（5）：422-425.
[3] Papantoniou VJ， Souvatsoglou MA，Valotassiou VJ，et a1.Relationship of cell nrolifemfion （Ki67） to 99mTc2（V）DMSA up take in breast cancer[J].Breast Cancer Res，2004；6（2）：56—62.
[4]Klintman M，Benddll PO，Grabau D，et al.The prognostic Value 0f Ki67 is dependenton estrogen receptor status and histological grade in premenopausal patients with node-negative breast cancer[J].Mod Pathol，2010；23（2）：251-259.
[5] Retsky M，Baum M，Demicheli R et a1.Prognostic value of ki67 expression after short-term presurgjcal endocrine therapy for primary breast cancer[J].J Natl Cancer inst 2007，99（13）：1053—1054.